Вар) Ход реакцииОбычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 - 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 - 2 минут. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин. Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. (2 вар) На первой стадии двунитевую ДНК нагревают до 90оС для разделения цепей и получения однонитевой ДНК (а).Затем смесь охлаждают, чтобы произошла гибридизация с праймерами (б). Комплементарные цепи ДНК синтезируются в обоих направлениях, начиная от праймеров (в). Этот циклический процесс (цикл 1) повторяют с той же самой реакционной смесью (цикл 2, 3 и т.д.) 20-30-кратно. Двунитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. Их количество удваивается после каждого цикла до тех пор, пока почти все синтезированные фрагменты не будут соответствовать первоначальному фрагменту, ограниченному праймерами. Циклы нагревания и охлаждения проводятся в термостате-амплификаторе с программируемым температурным режимом. Применение: · Криминалистика · Установление отцовства
11. Основные методы современной биотехнологии. Методы секвенирования ДНК, его основные принципы, цели. (См. вопрос выше) Методы секвенирования: 1. Метод Эдмана (старый) 2. Метод Сэнгера (новый) Метод Эдмана, суть: ранний метод, 1956 год, Пэр Эдман, швед. Путем воздействия на пептидную цепь определенным набором реагентов происходит отщепление аминокислоты от конца цени, реакцию проводят несколько раз и таким образом узнают последовательность аминокислот в цепи. Фредерик Сэнгер расшифровал структуру инсулина (1958) и открыл метод секвенирования ДНК. Получил две Нобелевских премии. Широко используется для определения нуклеотидной последовательности ДНК. Стадии секвенирования ДНК классическим «методом терминаторов» по Ф. Сэнгеру: 1) Клонирование, а затем гибридизация изучаемого фрагмента ДНК с праймером, 2) ферментативный синтез ДНК в 4 пробирках с ДНК-полимеразой, 4 нуклеотидами, и радиомеченным ddNTP-терминатором 3) денатурацию полученных продуктов 4) электрофорез в полиакриламидном геле на 4-х дорожках (по числу типов нуклеотидов) 5) анализ результатов на радиоавтографе. Обычно можно различить 250—350 полос, т.е. прочитать последовательность в 250-350 п.н. Метод Сэнгера, суть: к цепочке вводится праймер (небольная одноцепочечная молекула ДНК, комплиментарная началу участка, который нужно отсеквенировать, запускается радиоактивный меченный дезоксинуклеотид. У дидезоксирибонуклеотидов отсутствует 3'-гидроксильная группа, поэтому после их включения в цепь дальнейший синтез обрывается. Таким образом, в каждой пробирке образуется набор фрагментов ДНК разной длины, которые заканчиваются одним и тем же нуклеотидом (в соответствии с добавленным дидезоксинуклеотидом). После завершения реакции содержимое пробирок разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях и проводят радиоавтографию гелей. Продукты четырёх реакций формируют «секвенирующую лестницу», которая позволяет «прочитать» нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК
12. Влияние окружающей среды на работу генов. Примеры влияния. Взаимодействие гена и окружающей среды — это процесс, в ходе которого на основе определённого генотипа и воздействия фактора среды проявляется фенотип. В узком смысле, в генетической эпидемиологии: взаимодействие гена и окружающей среды — сочетание двух факторов риска (генетического и средового), приводящее к резкому изменению фенотипа, отличающемуся от привычного. Представляет собой интерес как способ описания нелинейных изменений фенотипа, качественных скачков в переходе от нормального (здорового) фенотипа к патологическому, которые невозможно объяснить простым сложением действия генетического фактора (варианта гена) и действием среды в отсутствии этого фактора. Понятие взаимодействия генов и окружающей среды сопутствует определению наследуемости для описания вклада генетической изменчивости и изменчивости факторов среды в развитие фенотипа. При этом, в самом определении наследуемости предполагается, что взаимодейстие между этими факторами отсутствует, то есть дисперсией, связанной с взаимодействием гена и окружающей среды, можно пренебречь. Однако, не все фенотипические признаки могут моделироваться только на основе идентификации генотипического варианта и уровня воздействия среды, без учёта взаимодействия генов со средой. Методологически существует несколько подходов в определении и измерении взаимодействия с использованием аддитивных и мультипликативных моделей[1]. При использовании аддитивной модели расчитывается сравнительный риск развития фенотипа от независимого действия каждого из двух факторов и риск при одновременном действии этих факторов. В случае экспериментального подтверждения более высокого или более низкого риска в сравнении с суммой отдельных рисков может констатироваться взаимодействие. Таким образом, взаимодействие получает возможную интерпретацию, иногда также определяемую как синергическое воздействие. Использование мультипликативной модели может предполагать использование взаимодействия как отдельного параметра с расчётом вероятности и величины коэффициента взаимодействия в регрессионном анализе. Наличие статистической достоверности и отличие коэффициента от нуля указывает на взаимодействие между параметрами модели. Прямая интерпретация такого взаимодействия не представляется возможной. Оба способа оценки взаимодействия не предполагают непосредственного механического воздействия одного фактора на другой, а скорее — связь в метаболизме через цепочку воздействий внешних и генетических факторов. В медицине описано несколько примеров взаимодействия между генами и факторами среды, в частности — эффект взаимодействия между генетическими вариантами в HLA и курением в развитии аутоиммунных заболеваний. Так, при исследовании популяции больных ревматоидным артритом было выявлено, что у курильщиков с определенным аллелем гена HLA-DRB1 риск возникновения серопозитивного заболевания во много раз выше, чем у некурящих или у курильщиков без этого аллеля. Наличие взаимодействия между генами и факторами среды помогает объяснить относительно низкий эффект генетических вариантов как факторов риска комплексных заболеваний человека: исследования генетических факторов без учета воздействия среды не учитывают синергический эффект и не описывают взаимодействие.
Примеры влияния: Болезни «цивилизации» Раньше: · Тропики – диета без холестерина и соли · Частота аллелей, способствующих накоплению холестерина и соли = 0,40 В Европе = 0,05-0,15% Сейчас: Современное питание - фактор риска диабета, атеросклероза,гипертонии или избыточного веса 1. Непереносимость лактозы (гиполакатазия) - термин для описания патологических состояний, вызванных снижением уровня лактазы — фермента, необходимого для правильного переваривания лактозы. Разная активность лактазы у взрослых - не мутации гена, кодрующего этот фермент, а изменения в экспрессии гена, что может меняться даже в ходе жизни отдельных людей. Переносимость молока появилась с распространением гена толерантности к лактозе. Известно, что данный ген возник в Северной Европе около 5000 лет до н. э., где в настоящее время имеет наивысшую частоту. Хорошая переносимость молочного сахара дала носителям этого гена преимущества в борьбе за выживание и позволила широко распространиться. 2. Серповидноклеточная анемия и малярия. Cерповидноклеточная анемия – смертельная болезнь крови. Ею болеют гомозиготы по мутации в гене гемоглобина. Распространена болезнь в тропическом поясе (в Азии больше –талассемия). Оказалось, что мутация выгодна для гетерозигот, потому что от анемии они не умирают, зато малярийный плазмодий в их эритроцитах размножается гораздо хуже. 3. Вирус иммунодефицита. ВИЧ проникает в клетку, связываясь с рецептором. Есть люди, у которых этот рецептор отсутствует. Называется этот рецептор - хемокиновый рецептор ССR5. Найдена мутация в кодирующем его гене, делеция 32 нуклеотидов, (мутантный аллель называется CCR5delta32) которая прерывает синтез белка. Частота мутантного гена CCR5-Δ32 (делеция 32-х нуклеотидов), кодирующего белок-рецептор ВИЧ, который увеличивает продолжительность жизни у людей инфициро-ванных ВИЧ (гомозиготных по мутантному аллелю). Чаще такая гомозигота встреча-ется в Европе (у 5% населения) что связывают с бубонной чумой в средние века (му-тация повышала также устойчивость к бацилле чумы). У африканцев больше распро-странены другие мутации, обусловливающие их устойчивость к ВИЧ.
13. Строение ДНК и РНК, кодирование наследственной информации. ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота состоит из 2х спирально закругленных цепей, которые по всей длине соединены друг с другом водородными связями – двойная спираль. ДНК представляет собой спираль, состоящую из двух комплементарных полинуклеотидных цепей, закрученных вправо. В состав нуклеотидов ДНК входят: · азотистое основание · дезоксирибоза · остаток фосфорной кислоты.
Азотистые основания делят на 3. пуриновые (аденин и гуанин) 4. пиримидиновые (тимин и цитозин). Две цепи нуклеотидов соединяются между собой через азотистые основания по принципу комплементарности: между аденином и тимином возникают две водородные связи, между гуанином и цитозином – три. Нуклеотиды, входящие в состав ДНК, содержат дезоксирибозу, остаток фосфорной кислоты и одно из 4х аминокислотных оснований. Каждая цепь ДНК – полинуклеотид, состоящий из множества нуклеотидов, последовательно соединенных за счет образования ковалентной связи между дезоксирибозой и остатком фосфорной кислоты разных нуклеотидов. Азотистые основания одной цепи образуют водородные связи с азотистыми основаниями другой в строгом порядке: против АДЕНИНßà ТИМИН, ГУАНИН ßà ЦИТОЗИН. Аденин, Гуанин – аминопроизводные пурина (+ кофеин); Тимин, Цитозин, Урацил – аминопроизводные пиримидина. Такой принцип строгого соответствия аминокислот называется принципом комплементарности.
Репликация ДНК - самоудвоение ДНК. В новообразованной цепи последовательность нуклеотидов определяется их последовательностью в первичной ДНК. Одна цепь принадлежит материнской молекуле, другая синтезируется. ДНК-полимераза катализирует синтез новых цепей. Репликация начинается одновременно на многих участках ДНК, а потом участки ДНК собираются в единое целое. При репликации ДНК плотность конечных ошибок намного ниже, чем при транскрипции или трансляции (чинится полимеразой, а затем репарационным комплексом из 4-х белков). Это связано с тем, что «стоимость» ошибки здесь выше: от этого зависит не только существование данной клетки, но и ее потомков. Транскри́пция (от лат. transcriptio — переписывание) — процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы, происходящий во всех живых клетках. Другими словами, это перенос генетической информации с ДНК на РНК. Транскрипция катализируется ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Процесс синтеза РНК протекает в направлении от 5'- к 3'- концу, то есть по матричной цепи ДНК РНК-полимераза движется в направлении 3'->5'[1] Транскрипция состоит из стадий инициации, элонгации и терминации. Единицей транскрипции является транскриптон, фрагмент молекулы ДНК, состоящий из промотора, транскрибируемой части и терминатора. Трансляция (от лат. translatio — перевод) процесс синтеза белка из аминокислот на матрице информационной (матричной) РНК (иРНК, мРНК), осуществляемый рибосомой.
РНК РНК – одноцепочечный полимер из нуклеотидов. В состав нуклеотидов РНК входят · азотистые основания · углевод рибоза · остаток фосфорной кислоты;
Азотистые основания делят на: 1. пуриновые (аденин, гуанин) 2. пиримидиновые (урацил, цитозин)
3 вида РНК: 1. Информационная (матричная) РНК (и-РНК/м-РНК) выполняет функцию переноса наследственной информации из ядра в цитоплазму клетки (300-36000 н., 5%РНК). 2. Транспортная РНК (т-РНК), имеет самую короткую цепь, доставляет аминокислоты к рибосомам в процессе трансляции – биосинтеза белка (76-83 н., 10% РНК клетки). 3. Рибосомальная РНК (р-РНК) имеет цепь средней длины и определяет структуру рибосом (3000-5000 н., 80-85% РНК) + митохРНК
Белки не уникальны в регуляции реакций в клетке. Есть еще микроРНК – двунитевые короткие молекулы (сейчас известно более 1800), которые избирательно подавляют трансляцию мРНК.
|
