Студопедия — Аффинная хроматография
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Аффинная хроматография






Относительно слабое обратимое взаимодействие между молеку­лами биполимеров и сорбентом может осуществляться за счет сил биологического сродства. Такие силы действуют, например, между ферментом и его субстратом или ингибитором, антигеном и антите­лом, гормоном и рецептором и т. д. Для осуществления фракциони­рования по биологическому сродству, т. е. методом аффинной хро­матографии, один из «партнеров» такой пары химически закрепляют на матрице «биоаффинного» сорбента, а сорбцией и элюцией второго «партнера» управляют путем изменения условий биологического взаимодействия в результате введения в элюент солей, мочевины, детергентов, конкурирующих молекул или изменения его рН (см. рис. 4.1.1).

Рис. 4.1.1 Процесс афинной хроматографии

 

В большинстве случаев имеет место не хроматографический процесс фракционирования смеси веществ, а очистка одного из них путем избирательной сорбции, промывки и последующей десорбции. Впрочем, возможны варианты и истинной хроматографии, исполь­зующей явление аффинного взаимодействия. При этом фракциони­рованию подвергается смесь близко родственных биологических макромолекул, различающихся по своему сродству к одному тому же аффинному сорбенту.

Иногда явление биологического сродства используется только в процессе элюции. В этом случае вещество связывается с поверх­ностью твердого сорбента за счет ионного взаимодействия или сил адсорбции, а элюцию осуществляют путем увеличения его сродства к элюенту, куда вводят биологически родственные (в указанном выше смысле) молекулы. Такой процесс было бы точнее называть аффинной элюцией. Имеются примеры, когда один из партнеров аффинной пары имеет не биологическое происхождение, а представ­ляет собой, например, сложный краситель, пространственная конфи­гурация которого имитирует какую-либо биологическую структуру.

Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой из­бирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Не­редко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается лег­кой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалентного присоединения к матрице.

Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме — методами центрифугиро­вания и декантации.

Одной из разновидностью афинной хроматографии является металхелатная хроматография, основанная на образовании комплексов между нанесенным на сорбент ионом металла, например кадмия или никеля (никель-хелатная хроматография), и специфичеким линкером, обычно 6-10 остатков гистидина, химически связанным с целевым белком (Рис. 2). Особенно часто данный метод применяется при очистке генноинженерных белков, генетический код которых заклонирован в специально сконструированные плазмиды. В результате чего молекула белка экспрессируется с присоедененным полигистидиновым концом, за счет которого она специфичеки связывается ионом металла при нанесении на колонку, а примеси при этом не задерживаются, что позволяет достичь очень большой чистоты целевого продукта при минимальных затратах. Также, при необходимости возможно провести ренатурацию связанных с сорбентом белков (например обратным градиентом мочевины) после чего элюировать уже чистый биологически активный белок.

Рис.4.1.2. Прикрепление белка с гистидиновой зацепкой к грануле в аффинной колонке. Около 10 гистидиновых остатков присоединены к белку с помощью генетической инженерии, например, сочетанием сайт-специфического мутагенеза с полимеразной цепной реакцией (ПЦР) (см. Nolting, 1999b). Гистидиновые остатки прочно связываются с гранулами, сделанными из никель-хелатирующей смолы.

Также возможен несколько иной вариант аф­финной хроматографии, в котором неправильно свернутый белок с помощью шаперонов сворачивается правильным образом и элюируется буферным раствором (Рис.4.1.3).

 

Рис. 4.1.3. Исправление свертывания дорогих, плохо сворачивающихся, белков: шапероны, называемые также шаперонинами, при­креплены к гранулам, и развернутый или неправильно свер­нутый белок пропускается сквозь колонку. Шаперон взаимо­действует с образцом белка и катализирует его сворачивание в правильной конформации.

 

 







Дата добавления: 2015-09-07; просмотров: 3091. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Важнейшие способы обработки и анализа рядов динамики Не во всех случаях эмпирические данные рядов динамики позволяют определить тенденцию изменения явления во времени...

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ МЕХАНИКА Статика является частью теоретической механики, изучающей условия, при ко­торых тело находится под действием заданной системы сил...

Теория усилителей. Схема Основная масса современных аналоговых и аналого-цифровых электронных устройств выполняется на специализированных микросхемах...

Логические цифровые микросхемы Более сложные элементы цифровой схемотехники (триггеры, мультиплексоры, декодеры и т.д.) не имеют...

Случайной величины Плотностью распределения вероятностей непрерывной случайной величины Х называют функцию f(x) – первую производную от функции распределения F(x): Понятие плотность распределения вероятностей случайной величины Х для дискретной величины неприменима...

Схема рефлекторной дуги условного слюноотделительного рефлекса При неоднократном сочетании действия предупреждающего сигнала и безусловного пищевого раздражителя формируются...

Уравнение волны. Уравнение плоской гармонической волны. Волновое уравнение. Уравнение сферической волны Уравнением упругой волны называют функцию , которая определяет смещение любой частицы среды с координатами относительно своего положения равновесия в произвольный момент времени t...

Различие эмпиризма и рационализма Родоначальником эмпиризма стал английский философ Ф. Бэкон. Основной тезис эмпиризма гласит: в разуме нет ничего такого...

Индекс гингивита (PMA) (Schour, Massler, 1948) Для оценки тяжести гингивита (а в последующем и ре­гистрации динамики процесса) используют папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс (РМА)...

Методика исследования периферических лимфатических узлов. Исследование периферических лимфатических узлов производится с помощью осмотра и пальпации...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.009 сек.) русская версия | украинская версия