СИНТЕЗ НОВЫХ ТЕРМИНИРУЮЩИХ АГЕНТОВ ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ НА ОСНОВЕ ТРИФОСФАТОВ МОРФОЛМИНОВЫХ НУКЛЕОЗИДОВ

 

Тарасенко Ю.В.

Институт Химической Биологии и Фундаментальной Медицины СО РАН,

Нововсибирск, Россия.

Аспирант 1г.

yuliya.tarasenko@mail.ru

Научный руководитель: Абрамова Т.В.

 

Секвенирование ДНК является незаменимым методом для основных биологических исследований и для ряда прикладных областей, таких как биотехнология, диагностика и др. Современное автоматическое секвенирование основано на методе Сенгера, предложенном в 1977г. [1]. В качестве терминирующих агентов используют 2’,3’-дидезоксинуклеозидтрифосфаты. Однако, синтез 2’,3’-дидезоксинуклеозидтрифосфатов сложен из-за многостадийности процесса и лабильности гликозидной связи. Использование флуоресцентной вместо радиоактивной метки при определении последовательности нуклеиновых кислот осложняет процесс синтеза терминаторов. Поэтому актуальной является задача поиска новых методов синтеза флуоресцентных производных 2`,3`-дидезокси­нуклеозидтрифосфатов, либо поиск альтернативных модифицированных нуклеозидтрифосфатов в качестве терминаторов полимеразной реакции.

Морфолиновые производные нуклеозидов и нуклеотидов находят широкое применение в молекулярно-биологических исследованиях, так как обладают рядом полезных и уникальных свойств в совокупности с простым строением. Мы предлагаем обратить внимание на возможность применения данных соединений в качестве терминирующих агентов для секвенирования нуклеиновых кислот.

За исходные соединения в синтезе морфолиновых и флуоресцентно меченых морфолиновых нуклеотидов были взяты соответствующие рибонуклеозиды [2].

 

Схема синтеза морфолиновых аналогов нуклеозидов

 

Перед синтезом морфолиновых нуклеозидтрифосфатов вводили защитные группы по экзоциклическим аминогруппам гетероциклических оснований рибонуклеозидов. Синтез производных 4a-e проводили в три стадии. На первой стадии защищенный рибонуклеозид подвергали обработке периодатом натрия. К полученному диальдегиду 2a-e без выделения добавляли аминокомпонент (4,9-диокса-1,12-додекандиамин). Промежуточное диоксосоединение 3a-e, также без промежуточного выделения, восстанавливали цианборгидридом натрия. В результате были получены соединения 4a-e с выходом 50-70%.

Трифосфаты морфолиновых нуклеозидов получены путем фосфорилирования 5’-гидроксигруппы морфолиновых нуклеозидов 4a-e, с выходом 50-60% [3].

Флуоресцентные красители ковалентно присоединяли к алифатической аминогруппе линкера морфолинового нуклеозидтрифосфата методом активированных эфиров. Реакцию проводили в водно-органической среде [4].

Таким образом, нами был синтезирован набор терминаторов, состоящий из модифицированных нуклеозидтрифосфатов в том числе флуоресцентно меченных, для секвенирования нуклеиновых кислот. Ранее было показано, что трифосфат морфолинового производного риботимидина является терминирующим субстратом термофильной Taq ДНК-полимеразы и специфично включается в положения, комплементарные аденину [5]. В статье [6] исследовали субстратные свойства трифосфатов морфолиновых производных нуклеозидов (U, A, G, C). Было доказано, что данные соединения являются субстратами ДНК-полимеразы β и обратной транскриптазы HIV-1. В настоящее время проводятся исследования по изучению субстратных свойств полученных нами соединений в системе матрично-зависимого ферментативного синтеза ДНК.

Работа осуществлена при поддержке фонда «Современное естествознание» (образовательный грант № P12-061).

 

Литература:

[1]. Sanger F., Nicklen S., Coulson A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467(1977).

[2]. Gritsenko O.M., Gromova E.S., Russ. Chem. Rev. 68, 241-251 (1999).

[3]. Abramova T., Vasileva S., Koroleva L., Kasatkina N., Silnikov V., Bioorgan. Med. Chem., 16, 9127-9132 (2008).

[4]. Тарасенко Ю.В., Васильева С.В., Абрамова Т.В., Сильников В.Н., Изв. АН, Сер. Хим. №2 (2012).

[5]. Marsiaq F., Sauvaigo S., Issartel J., Mouret J., Molko D., Tetrahedron Lett. 40, 4673-4676 (1999,).

[6]. Лебедева, Н.А., Середина, Т.А., Сильников, В.Н., Абрамова, Т.В., Левина, А.С., Ходырева, С.Н., Речкунова, Н.И., Лаврик, О.И., Биохимия, Т.70, 5-123 (2005).