АНАЛИЗ ДВУХКОМПОНЕНТНЫХ СМЕСЕЙ

(на примере аминокислот)

 

В основе количественного определения состава смесей спектрофотометрическими методами лежит правило аддитивности: поглощение света раствором любой смеси является суммой поглощений отдельных компонентов.

При условии выполнения закона Ламберта-Бугера-Бера

 

D = ε · c · l (1)

 

где D – оптическая плотность

ε - коэффициент экстинциии

c - концентрация соединения в растворе (моль/л)

l - толщина слоя (кюветы) раствора в сантиметрах

 

и известных коэффициентах экстинции для каждого вещества в отдельности измеряемая оптическая плотность смеси при любой длине волны может быть найдена по уравнению:

 

D = (ε₁ · c₁ + ε₂ · c₂ + ε₃ · c₃ + …) · l (2)

 

Если в смеси содержится n компонентов, то измерения оптической плотности должны быть проведены при n различных длинах волн и, соответственно, должны быть решены n уравнений. Этот метод особенно широко применяется для анализа двухкомпонентных систем. Две длины волны выбираются таким образом, чтобы при одной из них интенсивности поглощения соединений сильно различались, а при другой оба вещества имели бы достаточно сильное поглощение. Существенно также, чтобы выбранные длины волн находились на участках спектральных кривых с малым наклоном (обычно в точках, близких к максимумам и минимумам полос), поскольку, когда небольшие изменения длины волны сопровождаются большими изменениями оптической плотности, точность определения значительно снижается.

В данной работе предлагается проанализировать смесь двух аминокислот, входящих в состав белков – триптофана (α – амино - β-индолилпропионовая кислота) и тирозина (α - амино-β-(пара-гидроксифенил) пропионовая кислота).

 

 

Эти аминокислоты имеют избирательное поглощение в области 220 – 350 нм.

 

Тирозин λ при 294 нм (ε²⁹⁴ = 2550) в 0.1 М растворе NaOH

Триптофан λ при 281 нм (ε²⁸¹ = 5000) в 0.1 М растворе NaOH

 

Кривые поглощения этих аминокислот пересекаются в точках 294 и 257 нм (изобестические точки), в в которых ε_тир = ε_три. Тогда из уравнения (2) можно легко определить сумму молярных концентраций:

 

с = с₁ + с₂ = D²⁹⁴ / ε²⁹⁴ = D²⁵⁷ / ε²⁵⁷ (3)

 

Измерив интенсивность еще при одной длине волны λ, находят содержание каждой аминокислоты в смеси:

 

C₁ = (D^λ – ε₂^λ · c) / (ε₁^λ – ε₂^λ) (4)

 

Индекс 1 относится к тирозину, 2 – к триптофану.

 

Порядок выполнения работы

 

1. Приготовьте растворы аминокислот в 0.1 М растворе NaOH следующих концентраций: триптофан – 2·10^{-4 М, тирозин – 3·10-4 М.}

2. Запишите на спектрофотометре индивидуальные спектры тирозина и триптофана в области 220 – 350 нм.

3. Рассчитайте с помощью формулы (1) коэффициент экстинции тирозина при 281 нм.

4. Смешайте исходные растворы триптофана и тирозина в отношении 3: 2, соответственно и запишите на спектрофотометре спектр их смеси.

5. Рассчитайте суммарную концентрацию аминокислот в их смеси по уравнению (3), используя значение оптической плотности раствора аминокислот при 294 нм.

6. Рассчитайте с помощью уравнения (4) концентрацию каждой аминокислоты, используя значение оптической плотности смеси при 281 нм.

7. Зная точное значение концентраций тирозина и триптофана, определите ошибку измерения.

 

Лабораторная работа № 3: