Основы. Клонирование целых животных

Клетки животных, дифференцируясь, лишаются тотипотентности, и в этом – одно из существенных их отличий от клеток растений. Именно здесь главное препятствие для клонирования взрослых позвоночных животных. Методы клонирования целых животных до сих пор не доведены до стадии практического («промышленного») применения.

Наиболее удачными являются эксперименты по клонированию животных из эмбриональных недифференцированных клеток, не утративших тотипотентных свойств, однако есть положительные результаты и со зрелыми клетками.

Процесс клонирования протекает следующим образом – ядро соматической клетки пересаживают в лишенную ядра (энуклеированную) яйцеклетку и имплантируют ее в организм матери (если это животное, требующее вынашивания).

Энуклеация традиционно проводится микрохирургически или путем разрушения ядра ультрафиолетом, пересадка производится с помощью тонкой стеклянной пипетки или электрослиянием. В последнее время ученые из датского Института сельскохозяйственных наук разработали недорогую технологию клонирования, которая гораздо проще используемой ныне.

По новой технологии, яйцеклетки разрезаются пополам, и половинки с ядрами выбрасываются. Выбирается пара оставшихся пустых половинок, которые «склеиваются» в одну яйцеклетку после добавления нового ядра. Самая дорогая часть оборудования, которую использовали в этом эксперименте, — машина для «сварки» клеток — стоит всего лишь $3,5 тысячи. Технология может быть полностью автоматизирована и поставлена «на поток».

Успешность пересадки зависит от вида животного (амфибий клонируют успешнее, чем млекопитающих), методики пересадки и степени дифференцировки клетки-донора. Так, ещё Бриггс и Кинг в первых опытах на амфибиях установили, что если брать ядра из клеток зародыша на ранней стадии его развития – бластуле, то примерно в 80% случаев зародыш благополучно развивается дальше и превращается в нормального головастика. Если же развитие зародыша, донора ядра, продвинулось на следующую стадию – гаструлу, то лишь менее чем в 20% случаев оперированные яйцеклетки развивались нормально. Эти результаты позже были подтверждены и в других работах.

Во многих работах показано, что в случае амфибий донорами ядер могут быть лишь зародыши на ранних стадиях развития, хотя и клоны дифференцированных клеток удавалось «доводить» до поздних стадий, особенно при использовании метода серийных пересадок.

Опыты с амфибиями показали, что ядра различных типов клеток одного и того же организма генетически идентичны и в процессе клеточной дифференцировки постепенно теряют способность обеспечивать развитие реконструированных яйцеклеток, однако серийные пересадки ядер и культивирование клеток in vitro в какой-то степени увеличивает эту способность.

У млекопитающих в качестве доноров используются малодифференцированные стволовые клетки или клетки ранних эмбрионов. Работа методически оказалась довольно трудной, прежде всего потому, что объем яйцеклетки у млекопитающих примерно в тысячу раз меньше, чем у амфибий. Однако эти трудности были успешно преодолены. Экспериментаторы научились микрохирургически удалять пронуклеусы из зигот (оплодотворенных яйцеклеток) млекопитающих и пересаживать в них клеточные.

Опыты на мышах закончились полной неудачей – клоны гибли на стадии бластоцисты, что связано очевидно, с очень ранней активацией генома зародыша – уже на стадии 2-х клеток. У других млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-клеточной стадии. Возможно поэтому первые значительные успехи в клонировании эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах.

Была в целом решена проблема клонирования крупного рогатого скота. Например, в одном из экспериментов, 92 яйцеклетки из 463 развились до взрослых коров.

Позднее были получены клоны овец. В 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством Уилмута получила клон овец – 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4.Родилось 5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.

Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, - значительное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь шумного интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в начале 1997 года, где сообщалось, что в результате использования донорского ядра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное - овца по кличке Долли.

Успех^[3] авторов этой работы прежде всего связан с использованием длительных клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, вероятно, и были использованы как доноры ядер. Большое значение также имел тот факт, что авторы, учитывая результаты своих предыдущих работ, синхронизировали стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток доноров.

Из других млекопитающих были успешно клонированы свиньи.

Из изложенного выше следует, что методически или технически клонирование взрослых млекопитающих разработано еще недостаточно для практического применения. Для этого необходимо расширить круг исследований, включив в него, кроме овец, представителей и других видов животных. Такие работы необходимы, чтобы установить, не ограничивается ли возможность клонирования взрослых млекопитающих особенностями или спецификой какого-либо одного или нескольких видов.

Затем необходимо существенно повысить выход жизнеспособных реконструированных эмбрионов и взрослых клонированных животных, выяснить, не влияют ли методические приемы на продолжительность жизни, функциональные характеристики и плодовитость животных. Для клонов высок риск дефектного развития реконструированной яйцеклетки, главной причиной которого может быть неполное репрограммирование генома донорского ядра.

Что же касается возможности клонирования человека, который вызвал бурную реакцию общества, то о ней говорить пока не приходиться.