ГЕМОЛІЗ. ВИЗНАЧЕННЯ КІЛЬКОСТІ ГЕМОГЛОБІНУ і КОЛЬОРОВОГО ПОКАЗНИКА.ОТРИМАННЯ КРИСТАЛІВ ГЕМІНУ ТА ГЕМОГЛОБІНУ

Мета Вивчення дії на еритроцити різних хімічних речовин. Визначення концентрації гемоглобіну та кольорового показника в крові. Отримання та ідентифікація кристалів геміну та гемоглобіну.

 

Прилади та матеріали. Мікроскоп, пробірки, предметні та накривні скельця, гемометр Салі, стерильний скарифікатор, вата, спирт, скляні палички, піпетки, фільтрувальний папір, дистильована вода, 100мл 1% розчину NaCl, йод, 0, 1 н. розчин соляної кислоти, фізіологічний розчин, 5% розчин аміаку, 0, 1 % розчин соляної кислоти, кристалічний NaCl, льодяна оцтова кислота, канадський бальзам, хлороформ, 1 мл крові тварини.

 

Об’єкт дослідження Кров для аналізу.

 

Питання для теоретичної підготовки Будова та функції еритроцитів. Гемоліз, які причини його викликають. Кольоровий показник. Гемоглобін, його будова і значення для газообміну.

 

Завдання 1 Спостереження гемолізу.

1. У штативі ставлять 4 пробірки, в які наливають по 3 мл відповідно: в 1-шу – фізіологічного розчину, в 2-гу – дистильованої води, в 3-тю – 0, 1 %-го розчину НС1, у 4-ту – 5% розчину аміаку. В усі пробірки вносять піпеткою по 2 краплини цитратної крові. Пробірку з кров’ю, що в ній залишалася, ставлять у морозильну камеру холодильника на одну годину, потім виймають і розморожують у склянці з гарячою водою. Розглядають вміст усіх 5 пробірок, визначають наявність чи відсутність гемолізу.

2. Краплину крові розбавте фізіологічним розчином, покладіть на предметне скло і розгляньте під мікроскопом. Згодом на край предметного скла нанесіть краплину дистильованої води, що швидко заходить під покривне скельце і впливає на еритроцити, які спочатку набрякають, а згодом зникають. Якщо на край накривного скельця нанести розчин йоду, то строма еритроцита забарвлюється в жовтий колір.

Завдання 2 Визначення осмотичної стійкості еритроцитів.

Візьміть ряд пробірок, запишіть їх номери, приготуйте розчини кухонної солі різної концентрації(0, 1% 0, 2%...1%), добавте до них по 0, 5 мл 20% суспензії крові, перемішайте і поставте на 1 год. Після цього спостерігайте, в якій пробірці стався повний, частковий, або зовсім не відбувався гемоліз. При повному гемолізі спостерігається забарвлення розчину, при відсутності його залишається прозорим, безбарвним, а еритроцити осядуть на дно; при частковому гемолізі зруйновані еритроцити забарвлюють розчин, а цілі – осядуть на дно. Отже, еритроцити тієї самої крові мають неоднакову осмотичну стійкість відносно гіпотонічних розчинів. Для здорових людей мінімальна стійкість лежить у межах 0, 46-0, 58% NaCl, а повний гемоліз настає при 0, 30-0, 32% NaCl.

 

Завдання 3 Визначення кількості гемоглобіну в крові.

Вміст гемоглобіну в крові встановлюють за допомогою гемометра Салі. Він складається з штативу (задня стінка виготовлена з матового скла), в який поміщені три пробірки однакового діаметру. Дві крайні пробірки запаяні і містять розчин солянокислого гематину, середня градуйована і відкрита. До приладу додається капіляр з міткою 20 мкл (капіляр Салі), скляна паличка та піпетка.

В середню пробірку гемометра на­ливають 0, 1N розчин НС1 до нижньої кільцевої мітки. В капіляр Салі до мітки набирають кров, видаляючи над­лишок з кінчика капіляра фільтруваль­ним папером. Видувають кров в серед­ню пробірку так, щоб верхній шар розчину кислоти залишався не зафарбованим. Не виймаючи піпетки з розчину, ополіскують її у верхньому шарі.

Після цього вміст пробірки перемішують, вдаряючи пальцем по дну пробірки, і залишають стояти 5-10 хв (для перетворення гемоглобіну в солянокислий гематин).

Перемішуючи скляною паличкою, краплями додають дистильовану воду до того часу, коли його колір співпаде з кольором стандартного розчину. Цифра, яка стоїть на рівні нижнього меніску отриманого розчину, показує вміст гемоглобіну в крові, що досліджується в грам-процентах.

Розрахуйте відносний відсотковий вміст гемоглобіну в одиницях Салі за формулою:

 

Х = (100 ´ Gem)/ 16, 7, де

 

Gem – вміст гемоглобіну в г%

Порівняйте кількість гемоглобіну у жінок та чоловіків і зробіть висновки.

Зниження концентрації гемоглобіну в крові спостерігається при різних анеміях (через кровотечу, нестаток заліза, цианокобаламіну (віт. В12), фолієвої кислоти, при підвищеному гемолізі еритроцитів).

Підвищення концентрації гемоглобіну в крові трапляється при збільшенні кількості еритроцитів, легенево-серцевій недостатності, пороках серця.

 

Завдання 4. Визначення кольорового показника.

Кольоровий показник характеризує ступінь насиченості еритроцитів

Кольоровий показник є часткою відділення відносного вмісту гемог­лобіну (Г%) на відносну кількість еритроцитів (Е%).Визначають за формулою:

 

КП = (Г%) / (Е%),

Відносну кількість еритроцитів (Е%), визначають, поділивши знайдену їх кількість на середній вміст еритроцитів у крові здорової людини. При цьому, за 100% еритроцитів умовно приймають 5*10¹² /л, а за 100% (або одиниць) гемоглобіну умовно приймають величину 166, 7 г/л.

У нормі кольоровий показник крові дорівнює 0, 75-1, 05

 

Кольоровий показник можна розрахувати за спрощеною формулою:

 

КП = (вміст гемоглобіну в г/л * 3): три перших числа еритроцитів у 1 мкл крові

При анеміях величина його може бути більше вказаного числа (гіперх­ромні анемії) і менше (гіпохромні анемії). У новонароджених у перші дні життя кольоровий показник дещо перевищує одиницю. Зниження величини кольорового показника крові нижче норми може бути виявлене при хронічній постгеморрагічній та залізодефіцитній анеміях.

 

Завдання 5 Отримання кристалів геміну.

До розмазаної тонким шаром і висушеної краплини крові на предметному склі добавте одну-дві краплини льодяної оцтової кислоти та кілька кристаликів хлориду натрію. Накрийте накривним скельцем і підігрійте до кипіння та зникнення запаху кислоти, що відповідає часу парування рідини. Препарат після підсушування розгляньте під мікроскопом; видно буде дрібні кристалики солянокислого гемі ну із зрізаними навскоси краями.

 

Завдання 6 Отримання кристалів гемоглобіну.

· У пробірку з 1 мл крові морської свинки добавте дистильованої води та спирту в кількості 1/4 частини всієї рідини і поставте на холод, де почнуть кристалізуватися кристали гемоглобіну.

· У краплину канадського бальзаму, розбавленого хлороформом, добавте краплину свіжої крові, розмішайте, накрийте накривним скельцем і розгляньте під мікроскопом початок і дальшу кристалізацію гемоглобіну.

 

Питання для самопідготовки та контролю

1. Що таке гемоліз і які є його види?

2. Пояснить механізм гемолізу.

3. Що таке фарб-індекс і як його розраховують?

4. Які еритроцити мають назву гіперхромні, гіпохромні та нормохромні?

5. Які функції виконують еритроцити?

6. Як визначають осмотичну стійкість еритроцитів?

7. Значення гемоглобіну для газообміну.

8. Які фактори впливають на вміст гемоглобіну в крові?

9. Чому при гострому психічному стресі може статися інфаркт міокарду?

10. Злочинець, щоб приховати сліди злочину, спалив закривавлений одяг жертви. Однак судово-медична експертиза на основі аналізу попелу встановила наявність крові на одязі. Як це зробили?

11. Чи можна розглядати роботу буферних систем крові як прояв фізіологічної регуляції?

12. Після введення тварині певного препарату венозна кров стала такого ж кольору, як і артеріальна. На які процеси подіяв препарат?

 

Лабораторна робота № 3.