Иммуноферментный анализ

Рассмотренные методы в большей степени носят качественный или полуколичественный характер. При очень низких концентрациях компонентов образование комплекса антиген – антитело не может быть зарегистрировано ни визуально, ни простыми инструментальными средствами. Индикация комплекса антиген – антитело в таких случаях может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов – антиген или антитело – ввести метку, которую можно легко детектировать в концентрациях, сопоставимых с определяемой концентрацией анализируемого вещества. В качестве метки могут использоваться радиоактивные изотопы (например, ¹²⁵I), флюоресцентные вещества, ферменты. В зависимости от используемой метки различают радиоиммуный (РИА), флюоресцентный иммунный (ФИА), иммуноферментый (ИФА) методы анализа и др. В последние годы широкое практическое применение получил ИФА, что связано с возможностью количественных определений, высокой чувствительности, специфичности и автоматизации учета.

Иммуноферментные методы анализа – группа методов, которые позволяют выявить комплекс антиген – антитело с помощью субстрата, который расщепляется ферментом с появлением окраски.

Суть метода заключена в соединении компонентов реакции антиген – антитело с измеряемой ферментной меткой. Антиген или антитело, вступающие в реакцию, метятся ферментом. По превращению субстрата под действием фермента можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции антиген – антитело. Фермент в данном случае служит маркером иммунной реакции и позволяет наблюдать ее визуально или инструментально.

Ферменты представляют собой очень удобные метки, поскольку их каталитические свойства позволяют им действовать в качестве усилителей, так как одна молекула фермента может способствовать образованию более 1´ 10⁵ молекул продукта каталитической реакции в минуту. Необходимо подобрать такой фермент, который длительно сохраняет свою каталитическую активность, не теряет ее при связывании с антигеном или антителом, и обладает высокой специфичностью по отношению к субстрату.

Основные способы получения антител или антигенов, меченых ферментом, – конъюгатов: химические, иммунологические и генно-инженерные. Для постановки ИФА наиболее часто используются ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, галактозидаза и др.

Для выявления активности фермента в комплексе антиген-антитело с целью визуального и инструментального учета реакции используют хромогенные субстраты, растворы которых, изначально бесцветные, в процессе ферментативной реакции приобретают окраску, интенсивность которой пропорциональна количеству фермента. Так, для выявления активности пероксидазы хрена в твердофазном ИФА в качестве субстрата используют 5-аминосалициловую кислоту, дающую интенсивное коричневое окрашивание, орто -фенилендиамин, образующий оранжево-желтое окрашивание. Для выявления активности щелочной фосфатазы и β -галатозидазы используют нитрофенилфосфаты и нитрофенилгалактозиды соответственно.

Результат реакции при образовании окрашенного продукта определяют визуально или с помощью спектрофотометра, измеряющего поглощение света с определенной длиной волны.

Известно много вариантов постановки ИФА. Различают гомогенный и гетерогенный варианты.

По методике постановки различают конкурентный и неконкурентный методы ИФА. Если на первой стадии в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод является неконкурентным. Если на первой стадии присутствуют анализируемое соединение (антиген) и его аналог (меченый ферментом антиген), конкурирующие между собой за связывание с имеющимися в недостатке центрами специфического связывания (антителами), то метод является конкурентным. В этом случае чем больше исследуемого антигена содержит раствор, тем меньше количество связывающихся меченых антигенов.