Фенольным методом
Сахарами называют разновидности углеводов, хорошо растворимые в воде и имеющие сладкий вкус. К сахарам относятся моносахариды, олигосахариды и некоторые производные моносахаридов. Если принять за 100% сладость продовольственного сахара – сахарозы, то по данному показателю другие сахара распределяются следующим образом: сахароза …….. 100 ксилоза ………. 40 ксилит ………..200 мальтоза ………32 фруктоза ……..173 галактоза ……...32 глюкоза ………..74 рамноза ……….32 сорбит …………48 рафиноза ……...23 глицерин ………48 лактоза ………..16
Сахара, имеющие свободные альдегидную или кетонную (фруктоза) группы, способны вступать в окислительно-восстановительные реакции, поэтому их называют редуцирующими сахарами. К редуцирующим сахарам относятся моносахариды, а из олигосахаридов мальтоза, лактоза, целлобиоза, гентиобиоза. Редуцирующие сахара очень активно взаимодействуют с амнокисло-тами, образуя темноокрашенные продукты – меланоидины. На первом этапе взаимодействия аминокислот и редуцирующих сахаров образуются продукты их разложения: из сахаров – фурфурол или оксиметилфурфурол, а из аминокислот – альдегиды, углекислый газ и аммиак. На следующем этапе фурфурол или оксиметилфурфурол, вступая в соединение с аминокислотами, образуют меланоидины. Интенсивность реакции усиливается при повышен-ной температуре, которая создается при термической обработке рacтитeль-ной продукции в процессе сушки овощей, фруктов и продуктов из картофеля, выпечки хлеба, получения макарон и кондитерских изделий. Аналогичные явления наблюдаются при самосогревании зерна. Промежуточные продукты меланоидинообразования – альдегиды создают специфический запах, характерный для тех или иных пищевых продуктов. Фурфурол имеет запах яблок, оксиметилфурфурол – запах мёда, изовалериановый альдегид, образуемый из аминокислоты лейцина, – запах ржаного хлеба. Конечные продукты реакций взаимодействия аминокислот с редуцирующими сахарами – меланоидины вызывают потемнение раститель-ных продуктов, что ухудшает их товарные свойства. В процессе хлебопече-ния реакции образования меланоидинов влияют на формирование цвета, вкуса и аромата ржаного и пшеничного хлеба. В связи с возможным образованием меланоидинов, вызывающих потемнение и ухудшение товарных свойств растительной продукции при её сушке и переработке, содержание редуцирующих сахаров в растительном сырье контролируется и разработаны соответствующие методы их определения. Наиболее распространённые методы определения содержания отдельных сахаров в растительной продукции – разновидности бумажной и тонкослойной хроматографии, а общего количества редуцирующих сахаров – метод Бертрана и цианидный метод. Определение редуцирующих сахаров по Бертрану основано на их взаимодействии при нагревании с медновиннокислым комплексом (реакти-вом Фелинга), в ходе которого происходит окисление сахаров и образование осадка оксида меди (I). При этом масса полученного осадка пропорциональна концентрации сахаров в анализируемом растворе. Цианидный метод основан на титровании раствора редуцирующих сахаров раствором цианида железа (III) при нагревании и в присутствии индикатора. В ходе реакции сахара окисляются, а железо восстанавливается с образованием цианида железа (II). По количеству затраченного на титрование раствора цианида железа (III) рассчитывается содержание редуцирующих сахаров в растительном образце. В живых организмах сахара являются основными субстратами дыха-тельных реакций, в ходе которых синтезируются важнейшие биоэнергетичес-кие продукты и промежуточные метаболиты, служащие исходным материа-лом для синтеза других жизненно необходимых для организмов химических веществ. В связи с этим они являются важными компонентами пищи человека и кормов для животных, в значительной степени определяющими их питательную ценность. Сахара содержатся во всех органах растений, а в ряде растительных продуктов накапливаются в значительных количествах как запасные вещества (корнеплодах, овощах, плодах и ягодах). Преобладающими сахарами в этих растительных продуктах являются глюкоза, фруктоза и сахароза. Отдельные разновидности растительных продуктов различаются как по общему содержанию сахаров, так и по соотношению глюкозы, фруктозы и сахарозы. Содержание сахаров в растительной продукции варьирует в значительных пределах в зависимости от генотипа выращиваемой культуры, природно-климатических условий, режима питания растений. Возможные средние пределы варьирования указанного показателя и соотношения сахаров в растительных продуктах представлены в таблице 1. Для определения общего содержания сахаров в растительной продукции применяются указанные выше метод Бертрана и цианидный метод после предварительного гидролиза сахарозы с образованием глюкозы и фруктозы, способных восстанавливать реактив Фелинга или цианид железа (III). При определении сахаров в продуктах кондитерского производства применяет метод, основанный на окислении сахаров дихроматом калия в сильнокислой среде. Причём под воздействием данного окислителя окислению подвергаются не только сахара, но и их спиртовые производные. Таблица 1 Содержание сахаров в растительной продукции
Разработан также полумикрометод определения сахаров, который вследствие применения фенолового реактива получил название фенольного метода. Принцип метода. Метод основан на взаимодействии продуктов разложения сахаров в сильнокислой среде с фенолом, в результате которого образуются продукты конденсации, окрашенные в жёлто-оранжевый цвет. Интенсивность окраски в определённых пределах концентраций пропорцио-нальна количеству сахаров в растворе. Под воздействием кислой среды при нагревании сахароза и другие олигосахариды подвергаются гидролизу с образованием моносахаридов, которые затем в результате дегидратации (отщепления молекул воды) превращаются в фурфурол или оксиметил-фурфурол. Образование оксиметилфурфурола из глюкозы можно предста-вить в виде следующей реакции:
/ \ । НОН₂ С–С С–С=О Н⁺ ॥ ॥ ¾ ¾ ® НС ¾ СН + 3Н₂ О
D-глюкоза 5-оксиметилфурфурол
Фурфурол и оксиметилфурфурол далее вступают в реакции конден-сации с фенолом, образуя продукты конденсации, окрашенные в жёлто-оранжевый цвет. Оптическую плотность полученного окрашенного раствора определяют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре. Для реакции с фенолом используется раствор сахаров, очищенный от аминокислот, которые также могут взаимодействовать с фурфуролом и оксиметилфурфуролом с образованием меланоидинов. Поэтому при выделении сахаров из растительных проб проводится их избирательная экстракция этиловым спиртом, а затем после удаления спирта выпариванием получают водный раствор сахаров, который далее берётся для колориметри-ческого анализа. Расчёт количества сахаров проводится на основе сопоставления оптической плотности анализируемого раствора и набора стандартных растворов с известной концентрацией сахара. Данный метод отличается высокой чувствительностью и позволяет определять количество сахаров в анализируемой пробе до 10 мкг. Оборудование. Весы технические с точностью взвешивания до 0, 01 г; весы аналитические; гомогенизатор или фарфоровая ступка с пестиком диаметром 10-15 см; препаративный набор для измельчения растительного материала; терморегулируемая водяная баня; склянки для спирта, концентрированной серной кислоты и раствора фенола с дозирующими устройствами; эксикатор; конические колбы объёмом 100 мл с обратными холодильниками; мерные колбы с пластмассовыми или стеклянными притёртыми пробками объёмом 50 мл; мерные колбы объёмом 50, 100, 500 мл; воронки стеклянные диаметром 5-8 см; чашки фарфоровые диаметром 10 см; пробирки стеклянные термостойкие объёмом 20 мл; фотоэлектроколори-метр или спектрофотометр с набором кювет; пипетки дозирующие для отбора аликвот 1-10 мл; стаканы стеклянные объёмом 150 мл; палочки стеклянные; фильтры беззольные; склянки для хранения реактивов. Реактивы. Фенол химически чистый; кислота серная химически чистая с плотностью 1, 84 г/см³; сахароза химически чистая; спирт этиловый 96%; вода дистиллированная. Приготовление растворов. 1% водный раствор фенола: 5 г фенола помещают в стеклянный стакан объёмом 150 мл и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды; полученный раствор количественно переносят через воронку в мерную колбу объёмом 500 мл, доводят объём в колбе до метки, закрывают пробкой и перемешивают. Полученный раствор переливают в тёмную склянку. В целях безопасности приготовление данного реактива выполняется в вытяжном шкафу. Стандартный раствор сахарозы: навеску химически чистой сахарозы 100 мг ± 0, 01 мг, предварительно высушенной в термостате при температуре 60°С с последующим охлаждением в эксикатере, растворяют в 100 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. В 1мл полученного раствора содержится 1 мг сахарозы. 80% раствор этилового спирта: 416, 7 мл 96% этилового спирта разбавляют дистиллированной водой в мерной колбе на 500 мл, доводят объём раствора до метки и перемешивают. Ход определения. Для экстракции сахаров берётся навеска растительного материала (картофель, корнеплоды, овощи, плоды, ягоды, вегетативная масса растений) 1-2 г, содержащая до 50 мг сахаров, и подвергается измельчению в фарфоровой ступке или гомогенизаторе и затем количественно переносится с использованием 10 мл этилового спирта в коническую колбу объёмом 100 мл с обратным холодильником. Необходимый объём спирта отбирается с помощью дозирующего устройства. Колба с обратным холодильником помещается на водяную баню и выдерживается на ней в течение 15 минут при температуре 60°С. После охлаждения надосадочную жидкость (спиртовой экстракт сахаров) фильтруют через беззольный фильтр в колбу объёмом 50 мл с пластмассовой или притёртой стеклянной пробкой. К осадку в колбе с обратным холодильником приливают ещё 10 мл этилового спирта и повторяют экстракцию сахаров в течение 15 минут, после охлаждения надосадочную жидкость снова фильтруют в колбу с притёртой пробкой. Затем по указанной методике проводится третья экстракция сахаров, после чего спиртовой экстракт и остатки растительного материала из колбы с обратным холодильником переносят на фильтр; колбу с обратным холодильником и осадок на фильтре промывают 2-3 раза небольшим количеством тёплого 80% раствора этилового спирта. Объём раствора в колбе доводят до метки 80% этиловым спиртом и тщательно перемешивают. При анализе воздушно-сухого материала навеску уменьшают до 0, 25-0, 5 г в зависимости от содержания сахаров. Растительный материал растирают в фарфоровой ступке и указанную навеску измельчённого растительного материала помещают в колбу с обратным холодильником, приливают с помощью дозирующего устройства 10 мл этилового спирта, затем в течение 15 минут выдерживают на водяной бане при температуре 60°С, после чего надосадочную жидкость фильтруют в мерную колбу с притёртой пробкой. Последующие две экстракции сахаров проводятся на водяной бане по указанной выше методике и экстракты фильтруют в мерную колбу с притёртой пробкой. Осадок на фильтре промывают тёплым 80% раствором этилового спирта, объём раствора в колбе доводят до метки и содержимое колбы тщательно перемешивают. Для приготовления водного раствора сахаров дозирующей пипеткой отбирают 5 мл спиртового экстракта и помещают в фарфоровую чашку, которую ставят на водяную баню и оставляют на ней до полного выпаривания спирта. Выпаривание спирта проводится при температуре 60°С. Осадок сахаров в фарфоровой чашке растворяют в 10 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивая образующийся раствор стеклянной палочкой. Полученный водный раствор сахаров переносят в мерную колбу на 50 мл. Фарфоровую чашку несколько раз ополаскивают небольшими порциями дистиллированной воды, сливая её в мерную колбу. Объём раствора в мерной колбе доводят дистиллированной водой до метки и содержимое колбы тщательно перемешивают. Реакция сахаров с фенолом в присутствии концентрированной серной кислоты проводится в вытяжном шкафу с использованием термостойких пробирок на 20 мл. В пробирку сначала приливают дозирующей пипеткой 1 мл водного раствора сахаров, затем добавляют 1 мл 1% раствора фенола, полученную смесь перемешивают. Затем, удерживая пробирку за верхнюю часть, к полученной смеси приливают с помощью дозирующего устройства 5 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирки перемеши-вают, оставляют на 10 минут, после чего выдерживают на водяной бане 20 минут при температуре 30°С для формирования устойчивого окрашивания полученного раствора. Окрашенный раствор должен быть прозрачным, а если он мутный, то реакцию сахаров с фенолом нужно повторить до получения прозрачного окрашенного раствора. Интенсивность окраски полученного раствора оценивают колоримет-рированием на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при длине волны 490 нм и толщине фотометрируемого слоя 1 см. Оптическую плотность каждого раствора определяют не менее двух раз. Разница по оптической плотности между аналитическими повторениями не должна превышать 0, 01. Количество сахаров в анализируемой пробе устанавливают по градуировочному графику. Нулевую отметку шкалы оптической плотности на приборе настра-ивают по контрольному раствору, который получают при взаимодействии с феноловым реактивом в присутствии концентрированной серной кислоты 1 мл дистиллированной воды. Для построения градуировочного графика по указанной выше методике подвергают окрашиванию набор растворов сахара с известной концентрацией, которые готовят путём разбавления исходного стандартного раствора сахарозы с концентрацией 1мг/мл. В мерные колбы на 50 мл вносят пипеткой соответственно 1, 3, 5, 7, 9, 12, 15 мл исходного стандартного раствора сахарозы и объём раствора в колбах доводят до метки дистиллированной водой. В каждой колбе будет содержаться соответственно 1, 3, 5, 7, 9, 12, 15 мг сахарозы. Полученные водные растворы сахара в мерных колбах тщательно перемешивают. Затем из каждой колбы берётся по 1 мл раствора сахара и вносится в стеклянные термостойкие пробирки, в которых проводится их реакция с феноловым реактивом в присутствии концентрированной серной кислоты. После образования устойчивой окраски по указанной выше методике окрашенные растворы сахара колориметрируют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре. Полученные значения оптической плотности используют для построения градуировочного графика. По вертикальной оси откладывают значения оптической плотности окрашенных растворов сахара с известной концентрацией, а по горизонтальной оси – соответствующие количества сахарозы в мг, внесённые в мерные колбы на 50 мл. Обработка и оценка результатов. По оптической плотности анализи-руемого раствора с помощью градуировочного графика определяют массу водорастворимых сахаров (мг) в мерной колбе на 50 мл, которые содержались в 5 мл спиртового экстракта сахаров, взятого для выпаривания. Вычисление массовой доли сахаров в растительной пробе, взятой для анализа, с учётом разбавления производится по следующей формуле:
Мсах ∙ 50 ∙ 100 С = ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾, Н ∙ 5
где С – массовая доля сахаров в растительной пробе, %; Мсах – масса сахаров, определённая по градуировочному графику, мг; 50 – общий объём спиртового экстракта сахара, мл; Н – навеска растительного материала, мг; 5 – объём спиртового экстракта сахара, взятый для выпаривания, мл; 100 – коэффициент пересчёта в проценты. Рассчитанный показатель сравнивают с литературными сведениями, представленными в таблице 1, и делают соответствующие выводы о точности анализа и соответствии полученного результата теоретическим данным. Контрольные вопросы 1. Какие углеводы относятся к сахарам и редуцирующим сахарам? 2. Какова биологическая роль сахаров в растительном организме? 3. Как влияют сахара на формирование качества растительной продук-ции? 4. Что такое меланоидины и как они влияют на качество растительной продукции? 5. Каковы особенности различных видов растительной продукции по содержанию и составу сахаров? 6. Какими методами определяют общее содержание сахаров и редуцирующих сахаров в растительных продуктах? 7. Почему при определении сахаров фенольным методом проводится их экстракция из растительных проб этиловым спиртом? 8. Как получают водный раствор сахаров? 9. По какой методике окрашивают раствор сахаров с использованием фенолового реактива? 10. Как проводится колориметрирование окрашенных растворов сахаров? 11. Как строят градуировочный график для количественного определения сахаров? 12. Каковы принципы расчёта массовой доли сахаров в анализируемой пробе растительного материала? 13. Каковы особенности локализации сахаров в растительных продуктах? 14. Как влияют природно-климатические факторы и режимы питания растений на содержание сахаров в растительной продукции?
|
О Н
