Определение белков биуретовым методом

 

Белки представляют собой высокомолекулярные биополимеры, молекулы которых построены из остатков протеиногенных аминокислот, соединённых пептидными связями. Протеиногенные аминокислоты отличаются тем, что они кодируются в структуре белков кодонами генетического кода. Однако под воздействием физиологической среды остатки некоторых протеиногенных аминокислот в молекулах белков могут подвергаться модификации, в ходе которой образуются их структурные аналоги. Если белковые молекулы содержат только остатки аминокислот, соединённые пептидными связями, их называют протеинами. Кроме амино-кислотных остатков молекулы белков могут включать другие группировки не аминокислотной природы и такие белки называют протеидами.

Белковые молекулы выполняют в организмах жизненно важные функции. Все биохимические реакции в клетках организмов происходят с участием каталитически активных белков – ферментов. Структурные белки участвуют в построении биологических мембран цитоплазмы и внутриклеточных органоидов. Активную роль в обмене веществ организмов играют регуляторные и транспортные белки, способные обратимо изменять конформацию своих молекул. Белки иммунной системы организма выполняют защитную функцию. В запасающих тканях растений откладываются запасные белки, которые служат источниками энергии и протеиногенных аминокислот для формирующихся проростков.

Белки в значительной степени определяют питательную ценность и технологические свойства растительной продукции. Они служат основными источниками незаменимых аминокислот для человека и животных. По средним нормам питания человеку необходимо потреблять 8-10 г полноценного белка в расчёте на 1 МДж обменной энергии, содержащейся в пище; коровам – 8-12 г, свиньям – 10-14 г, птице – 12-15 г. Обменная энергия – часть общей энергии пищи человека или корма животных, доступная для использования в процессе обмена веществ организма.

Учитывая важную роль белков в питании человека и кормлении сельскохозяйственных животных, содержание белков контролируется в растительной продукции и относится к наиболее важным показателям качества зерна злаковых и зернобобовых культур, семян масличных растений, клубней картофеля, корнеплодов, овощей, плодов и ягод, вегетативной массы кормовых трав и кукурузы. Много белков накапливается в зерне зернобобовых культур – 20-30%, в сое и люпине – 30-40%, в семенах масличных растений – 15-30%. Содержание белков в другой растительной продукции составляет, %:

 

Зерновки злаковых культур 8-18 Брюссельская капуста 5-6

Зерно кукурузы 8-11 Чеснок 6-8

Зерно риса 6-9 Плоды и ягоды 1-2

Клубни картофеля 1, 5-2 Вегетативная масса (в расчёте на

Корнеплоды 1-1, 5 сухое вещество перед цветением):

Овощи 0, 5-2 бобовых трав 15-25

Цветная капуста 2-4 мятликовых трав 5-15

 

Количественное определение белков наиболее точно осуществляется методом Кьельдаля по белковому азоту, который умножают на коэффициент пересчёта в белки для соответствующего вида растительной продукции: зерно злаков – 5, 7-5, 8; зерно гречихи и зернобобовых культур – 6, 0; семян масличных растений – 5, 5; клубни картофеля, корнеплоды, овощи, плоды и ягоды, вегетативная масса растений – 6, 25. Белковый азот определяют методом Кьельдаля после удаления из анализируемой пробы небелковых азотистых веществ и озоления в серной кислоте осадка растворимых белков, а также структурных белков растительного остатка.

Очень часто при оценке химического состава растительной продукции используют более простые и быстрые методы определения белков, в которых используются цветные реакции на белки. Одним из таких методов является биуретовый метод, способный обеспечивать достаточно высокую точность определения белков в растворе при их концентрациях от 0, 04 до 2 мг/мл.

Принцип метода. Биуретовый метод основан на способности катионов меди (II) при взаимодействии в щелочной среде с группировками пептидных связей белков формировать устойчивые комплексы, окрашенные в сине-фиолетовый цвет. Интенсивность окрашивания зависит от концентрации белков в растворе. Количество белков в растворе определяют при сопоставлении оптической плотности анализируемого окрашенного раствора и набора окрашенных белковых растворов с известной концентрацией белков.

Оборудование. Баня водяная терморегулируемая; весы технические с точностью взвешивания ± 0, 01 г; весы аналитические; центрифуга с набором центрифужных пробирок; фотоэлектроколориметр или спектрофотометр с набором кювет; пипетки дозирующие на 1-10 мл; бюретки на 10-20 мл; ступки фарфоровые с пестиками диаметром 10 см; препаративный набор для измельчения растительного материала; мерные колбы с пробками на 50, 100, 200, 500 и 1000 мл; стеклянные стаканы на 150-200 мл; пробирки на 20 мл; воронки стеклянные диаметром 5-8 см; беззольные фильтры.

Реактивы. Спирт этиловый 96%; гидроксид натрия; мочевина; калий-натрий виннокислый; медь сернокислая (CuSO₄ ∙ 5H₂ O); калий йодистый; уголь активированный; тимол; белок растительный чистый; вода дистиллиро-ванная (свободная от СО₂).

Приготовление растворов. 0, 2 М раствор NaOH: 8 г NaOH помещают в термостойкий стакан и растворяют в дистиллированной воде; после охлаждения полученный раствор переносят в мерную колбу на 1л, доводят объём в колбе до метки дистиллированной водой и содержимое колбы тщательно перемешивают.

4% раствор NaOH: 4 г NaOH помещают в термостойкий стакан и растворяют в дистиллированной воде; после охлаждения полученный раствор переносят в мерную колбу на 100 мл, доводят объём в колбе до метки дистиллированной водой и содержимое колбы тщательно перемешивают.

Спиртовой раствор щёлочи: в мерную колбу на 200 мл приливают 100 мл 96% этилового спирта и доводят объём в колбе до метки 4% раствором NaOH, затем содержимое колбы тщательно перемешивают.

Раствор мочевины: в химический стакан объёмом 1 л помещают 300 г мочевины и 0, 5 г тимола, приливают 700 мл дистиллированной воды и полученную смесь нагревают до полного растворения мочевины и тимола; затем в раствор добавляют 3 г активированного угля, тщательно его перемешивают и фильтруют в мерную колбу на 1 л; объём раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой и содержимое колбы тщательно перемешивают.

Биуретовый реактив: 9 г калия-натрия виннокислого помещают в химический стакан и растворяют в 400 мл 0, 2 М раствора NaOH, затем в полученный раствор добавляют 3 г сернокислой меди и перемешивают его до полного растворения внесённого реактива; на следующем этапе в образовавшийся раствор добавляют 5 г йодистого калия и полученную смесь перемешивают до полного растворения йодида калия (если необходимо смесь нагревают); после охлаждения полученный раствор переносят количественно в мерную колбу на 1 л с использованием 0, 2 М раствора NaOH, доводят объём раствора в колбе до метки и содержимое колбы тщательно перемешивают. Биуретовый реактив хранят в тёмной склянке.

Стандартный белковый раствор: 0, 4 г чистого растительного белка растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл, в результате чего образуется белковый раствор с концентрацией белка 4 мг/мл.

Ход определения. Навеску растительного материала 1-2 г растирают в ступке до получения однородной массы, затем приливают 3 мл спиртового раствора щёлочи и полученную смесь интенсивно перемешивают пестиком в течение 15 минут для экстрагирования белков. После этого смесь из ступки переносят в центрифужную пробирку и подвергают центрифугированию с центробежным ускорением 5000 g в течение 10 минут. Прозрачную надоса-дочную жидкость в центрифужной пробирке переливают в стеклянную пробирку и далее используют для получения окрашенного раствора. Для этого в стеклянную пробирку на 20 мл с помощью дозирующей пипетки вносят 0, 2 мл белкового раствора, выделенного из растительной пробы, и к нему из бюретки добавляют 2, 4 мл раствора мочевины и 2, 4 мл биуретового реактива. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и затем пробирку выдерживают в течение 10 минут на водяной бане при температуре 40°С для формирования устойчивого окрашивания. После охлаждения окрашенный раствор колориметрируют на фотоэлектроколориметре или спектрофотомет-ре при длине волны 670 нм и толщине фотометрируемого слоя 1 см. После измерения оптической плотности окрашенного белкового раствора по градуировочному графику определяют количество белка в аликвоте 0, 2 мл, взятой для приготовления окрашенного раствора.

Для построения градуировочного графика колориметрированию подвергаются окрашенные растворы с известной концентрацией белков. По вертикальной оси откладываются значения оптической плотности окрашен-ных растворов с известной концентрацией белков, а по горизонтальной оси количество белка в мг, содержащегося в 0, 2 мл взятого для окрашивания белкового раствора. Набор растворов с известной концентрацией белков готовится в мерных колбах на 10 мл, в которые приливают соответственно 1, 5, 2, 5, 3, 5, 4, 5, 6, 8, 10 мл стандартного белкового раствора с концентрацией белков 4 мг/мл. Объём раствора в мерных колбах на 10 мл доводят до метки спиртовым раствором щёлочи и их содержимое тщательно перемешивают. Из каждой колбы отбирают по 0, 2 мл белкового раствора и производят их окрашивание по выше указанной методике с использованием раствора мочевины и биуретового реактива. В каждой аликвоте белкового раствора объёмом 0.2 мл будет содержаться соответственно 0, 12, 0, 2, 0, 28, 0, 36, 0, 48, 0, 64, 0, 8 мг белка.

Если оптическая плотность опытной пробы выходит за пределы граду-ировочного графика, то проводится повторное проведение окрашивания белкового раствора после его соответствующего разбавления. При этом не допускается разбавление окрашенного раствора, так как оно вносит ошибку в измерение оптической плотности.

Обработка и оценка результатов. Массовуюдолюбелков в анализируемой растительной пробе рассчитывают с учётом разбавления по следующей формуле:

Мб ∙ 3 ∙ 100

Х = ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾,

Н ∙ 0, 1

 

где Х – содержание белков в анализируемой растительной пробе, %;

Мб – масса белков в 0, 2 мл спиртового раствора, выделенного из растительной пробы, мг;

Н – навеска растительного материала, взятая для анализа, мг;

3 – общий объём выделенного из растительной пробы белкового раствора, мл;

0, 2 – объём выделенного белкового экстракта, взятый для приготовления окрашенного раствора, мл;

100 – коэффициент пересчёта в проценты.

Полученный результат сравнивают с теоретическими данными и оценивают качество растительной продукции по данному показателю.

 

Контрольные вопросы

1. Какие функции выполняют белки в клетках организмов?

2. Какова роль белков в питании человека и кормлении животных?

3. Как различаются по содержанию белков различные виды растительной продукции?

4. Какими методами определяют содержание белков в растительной продукции?

5. Какие принципы положены в основу определения белков биуретовым методом?

6. Каковы особенности выделения белков из растительных проб для их количественного определения биуретовым методом?

7. Как проводится окрашивание белкового раствора с использованием биуретового реактива?

8. Какова методика построения градуировочного графика?

9. Как осуществляется расчёт массовой доли белков в анализируемой растительной пробе по результатам колориметрирования окрашенных белковых растворов с использованием биуретового реактива?

10. Какое влияние оказывают природно-климатические факторы и режим питания растений на содержание белков в растительной продукции?