Спектрофотометрический метод определения белков

 

В биохимических опытах очень часто возникает необходимость оцени-вать концентрацию в растворе белков на промежуточных этапах их изучения с сохранением нативных свойств белковых молекул для проведения дальней-ших исследований. Для этих целей разрабатываются модификации их коли-чественного определения с помощью спектрального анализа. Одним из таких методов является определение белков на основе измерения оптической плот-ности их растворов в ультрафиолетовом диапазоне при длине волны 280 нм.

Принцип метода. Метод основан на способности группировок арома-тических аминокислот в составе белковых молекул (тирозина, триптофана, фенилаланина) поглощать ультрафиолетовое излучение при длине волны 280 нм.Белкивыделяют из растительной пробы соответствующим растворите-лем (вода, солевой раствор, щелочной буферный раствор и др.) с после-дующим центрифугированием и затем на спектрофотометре измеряют оптическую плотность полученного белкового раствора при длине волны 280 нм. Количество белков в растворе оценивают при сопоставлении оптической плотности анализируемого белкового раствора с оптической плотностью стандартного белкового раствора с известной концентрацией белков.

Если в анализируемом белковом растворе повышена концентрация нуклеиновых кислот, то они вносят ошибку в определение белков, так как способны поглощать ультрафиолетовое излучение при длине волны 280 нм, а максимум их поглощения наблюдается при длине волны 260 нм. Поэтому в данном случае спектрофотометрирование белкового раствора проводится при длинах волн 260 нм и 280 нм, а затем влияние нуклеиновых кислот на оптическую плотность белкового раствора исключается путём внесения соответствующей поправки.

Оборудование. Лабораторные весы; фарфоровые ступки с пестиками диаметром 6-8 см; центрифужные пробирки на 20 мл; среднескоростная центрифуга с центробежным ускорением до 15000 g; стеклянные пробирки на 20 мл; дозирующие пипетки на 0, 1-1 мл, 1-5 мл; мерные колбы на 50, 100, 500, 1000 мл; стеклянные воронки диаметром 5-6 см; спектрофотометр с кварцевыми кюветами.

Реактивы. Натрий хлористый; белок растительный стандартный; вода дистиллированная.

Приготовление растворов. 1% раствор хлорида натрия: 1 г хлорида натрия растворяют в 99 г дистиллированной воды и полученный раствор тщательно перемешивают.

Стандартный белковый раствор: в мерной колбе на 100 мл растворяют 100 мг растительного белка с использованием 1% раствора хлорида натрия, объём раствора в колбе доводят до метки и содержимое колбы тщательно перемешивают.

Ход определения. Навеску растительного материала 1 г (зерно злако-вых, зернобобовых культур, семян масличных растений, картофель, корне-плоды, овощи, плоды и ягоды), взвешенную с точностью до 0, 01 г, растирают в ступке с небольшим количеством кварцевого песка до получения однород-ной массы. К полученной смеси приливают 10 мл 1% раствора хлористого натрия и содержимое ступки интенсивно перемешивают в течение 15 минут. Затем смесь из ступки переносят в центрифужные пробирки и подвергают центрифугированию со скоростью 10-12 тысяч оборотов в минуту в течение 10 минут.

Полученный после центрифугирования белковый раствор переливают в стеклянную пробирку на 20 мл. Затем 0, 2 мл этого раствора переносят дозирующей пипеткой в другую стеклянную пробирку на 20 мл, приливают 9, 8 мл раствора хлорида натрия и содержимое пробирки тщательно перемешивают. Приготовленный таким образом разбавленный белковый раствор фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 280 нм и толщине фотометрируемого слоя 1 см. Затем по колибровочному графику определяют количество белков в анализируемом растворе.

Для построения калибровочного графика из стандартного белкового раствора путём разбавления готовят шкалу рабочих растворов с известной концентрацией белка. Для этого в 9 стеклянных пробирок на 20 мл вносят соответственно 0, 1, 0, 3, 0, 6, 0, 9, 1, 2, 1, 5, 1, 8, 2, 2, 2, 6 мл исходного стандартного белкового раствора, доводят объём раствора до 10 мл 1% раствором хлорида натрия и содержимое пробирок тщательно перемешивают. В приготовленных рабочих растворах будет содержаться соответственно 0, 1, 0, 3, 0, 6, 0, 9, 1, 2, 1, 5, 1, 8, 2, 2, 2, 6 мг белка. Рабочие белковые растворы фотометрируют по выше указанной методике при длине волны 280 нм и по полученным значениям оптической плотности строят колибровочный график.

Обработка и оценка результатов. Массовую долю белков в анализируемой растительной пробе рассчитывают по формуле:

Мб ∙ 10 ∙ 100

Х = ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾,

Н ∙ 0, 2

где Х – массовая доля белков в растительной пробе, %;

Мб – масса белков в фотометрируемой пробе, определённая по калибро-вочному графику, мг;

10 – объём белкового экстракта, выделенный из растительной пробы, мл;

100 – коэффициент пересчёта в %;

Н – исходная навеска растительного материала, г;

0, 2 – объём белкового раствора, взятый для приготовления фотометрируе-мой пробы, мл.

Если в анализируемой пробе содержатся нуклеиновые кислоты, концентрацию в ней белков определяют с учётом поправки на поглощение ультрафиолетового излучения нуклеиновыми кислотами по следующей формуле:

Сб = 1, 45Е₂ ₈ ₀ - 0, 74Е₂ ₆ ₀,

где Сб – концентрация белков в анализируемом растворе, мг/мл;

Е₂ ₈ ₀ – отсчёт оптической плотности белкового раствора, определённый при длине волны 280 нм;

Е₂ ₆ ₀ – отсчёт оптической плотности белкового раствора, определённый при длине волны 260 нм;

1, 45 – поправка на поглощение нуклеиновыми кислотами;

0, 74 – поправка на поглощение группировками ароматических амино-кислот, находящимися в составе белков.

Рассчитанную по указанной формуле концентрацию белков (мг/мл) умножают на объём раствора в пробирке (10 мл) и таким образом получают количество белков (Мб) в мг, которое содержится в 0, 2 мл белкового экстракта, выделенного из навески растительного материала. Окончательный расчёт массовой доли белков в растительной пробе выполняется по исходной формуле, представленной на странице 44.

На основе полученного результата оценивают качество растительной пробы, её питательные, кормовые и технологические свойства.

 

Контрольные вопросы

1. В чём состоят особенности определения белков спектрофотометри-ческим методом?

2. Как выделяют белки из растительной пробы?

3. Как учитывают поправку на нуклеиновые кислоты при определении белков спектрофотометрическим методом?

4. Какие белки можно определять спектрофотометрическим методом?

5. По какой методике проводится фотометрирование белковых растворов?

6. Каковы особенности приготовления шкалы рабочих растворов с известной концентрацией белков?

7. В чём заключается преимущество спектрофотометрического метода определения белков по сравнению с другими методами?