И А.И. Опарину

 

Нормальное осуществление биохимических реакций в живых организмах оказывается возможным благодаря тому, что в их клетках имеются биологические катализаторы, называемые ферментами. Они представляют собой специализированные формы белковых молекул, обладающих способностью катализировать биохимические превращения в клетках организмов. Каталитическая способность молекул ферментов выражается специальным показателем, который называют активностью фермента. Этот показатель можно определить по количеству прореагировавшего субстрата или по накоплению продуктов реакции в единицу времени. На основе указанных измерений оценивается скорость ферментативного превращения субстрата – вещества, на которое направлено действие фермента.

При определении активности ферментов в искусственной системе (вне организма) самая высокая скорость ферментативного превращения субстрата наблюдается в начале ферментативной реакции, а затем скорость реакции уменьшается вследствие понижения концентрации субстрата и одновремен-ного накопления образующихся продуктов, инициирующих прохождение обратной реакции. Поэтому каталитическую активность ферментов рекомен-дуется определять по начальной скорости реакции и за возможно короткий промежуток времени. При этом создаются оптимальные условия для проявления каталитической способности ферментных молекул (оптимальные температура, рН и ионный состав среды).

Каталитическую активность ферментов принято измерять в каталах (сокращённо кат) или производных от катала единицах – микрокаталах (мккат), нанокаталах (нкат), пикокаталах (пкат). Один катал – это каталити-ческая активность, способная катализировать превращение 1 моля субстрата за 1 секунду при оптимальных условиях для действия фермента. В каталах и производных от него единицах измеряется общая активность фермента, которая зависит как от каталитических свойств ферментного белка, так и количества ферментных молекул, участвующих в данной реакции. Для характеристики каталитических свойств молекул ферментов используется показатель – удельная активность фермента, который выражается в каталах и производных от него единицах в расчёте на единицу массы ферментного белка или на единицу массы биологического источника, из которого выделен фермент. В последнем случае показатель удельной активности выражает содержание фермента в биологическом источнике.

Важную функцию в организмах выполняет фермент каталаза (1.11.1.6), который предотвращает накопление пероксида водорода, инициирующего пероксидное окисление большого набора органических веществ и способного оказывать повреждающее воздействие на клеточные мембраны. Этот фермент катализирует разложение пероксида водорода на воду и кислород:

каталаза

2Н₂ О₂ ¾ ¾ ¾ ® 2Н₂ О + О₂

 

Каталаза в качестве кофермента содержит группировку протогема, включающего железо в виде Fe³ ⁺. Молекулы данного фермента представляют собой тетрамерные белки с молекулярной массой 250000, обладающие очень высокой каталитической активностью (2∙ 10⁵ кат в расчёте на 1 моль каталитических центров). В биохимических исследованиях и при оценке качества растительной продукции широкое распространение имеет метод определения активности каталазы, разработанный А.Н. Бахом и А.И. Опариным.

Принцип метода. Определение активности каталазы указанным методом основано на экстрагировании водой фермента из биологического материала, после чего в течение определённого времени проводится ферментная реакция при добавлении к раствору пероксида водорода водного экстракта каталазы. По окончании ферментной реакции в реакционной среде определяется количество пероксида водорода, которое не разложилось под действием фермента, титрованием в кислой среде раствором перманганата калия согласно следующей реакции:

5Н₂ О₂ + 2КМnO₄ + 3H₂ SO₄ = K₂ SO₄ + 2MnSO₄ + 5O₂ + 8H₂ O

Одновременно с анализируемой пробой проводится определение коли-чества пероксида водорода, оставшегося неразложившимся после проведения реакции с пероксидом водорода инактивированного фермента (контрольный вариант). В данной реакции происходит частичное разложение пероксида водорода неферментативным путём. По разнице между титрованием контроля и анализируемой пробы определяется количество пероксида водорода, которое подверглось разложению на воду и кислород под действием каталазы, и полученный результат используют для расчёта каталитической активности фермента.

Оборудование. Ступки фарфоровые с пестиками диаметром 8-10 см или гомогенизатор; марля для фильтрования; чашки фарфоровые диаметром 6-8 см; колбы конические на 50 мл и 150 мл; дозирующие пипетки на 1-10 см; дозирующее устройство на 5 мл для раствора серной кислоты; мерные колбы на 100 мл и на 1 л с пробками; тёмные склянки для растворов пероксида водорода и перманганата калия; бюретки для титрования на 20 мл, термостат.

Реактивы. Дистиллированная вода; концентрированный раствор пероксида водорода; концентрированная серная кислота; фиксанал перманганата калия.

Приготовление растворов. 1% раствор пероксида водорода: готовится свежий раствор перед каждым анализом путём разбавления концентрированного раствора в мерной колбе на 100 мл. Приготовленный раствор переливают в тёмную склянку.

10% раствор серной кислоты: в фарфоровый стакан на 500 мл наливают 300 мл дистиллированной воды, к которой с помощью дозирующего устройстваприливают 60, 6 мл концентрированной серной кислоты, полученную смесь перемешивают и после охлаждения переливают в мерную колбу на 1 л, ополаскивая стакан дистиллированной водой. Затем объём раствора в колбе доводят водой до метки и перемешивают. Приготовление данного реактива выполняется в вытяжном шкафу.

0, 1 н раствор перманганата калия: готовится из фиксанала в мерной колбе на 1 л. Приготовленный раствор переливают в тёмную склянку.

Ход определения. Навеску растительного материала 2 г (клубни картофеля, корнеплоды, проростки семян злаковых, зернобобовых, масличных культур, овощи, плоды и ягоды, вегетативная масса растений) взвешивают на лабораторных весах с точностью до 0, 01 г и растирают в ступке или измельчают в гомогенизаторе до получения однородной массы. В случае необходимости в ступку для лучшего растирания растительного материала добавляется в небольшом количестве чистый кварцевый песок. К измельчённому в ступке материалу приливается дозирующей пипеткой 20 мл дистиллированной воды для экстракции ферментного белка и полученную смесь интенсивно перемешивают пестиком в течение 15 минут. Затем в фарфоровую чашку помещают уложенную в 4 слоя марлю и на неё переносят полученную смесь из ступки, заворачивают края марлевой ткани и отжимают через 4 слоя марли растительный экстракт с растворённым ферментным белком.

В ходе последующего анализа в 2 конические колбы на 150 мл дозирующей пипеткой вносят по 5 мл ферментного экстракта и в одну из колб для инактивации ферментного белка (контроль) с помощью дозирующего устройства приливают 5 мл 10% раствора серной кислоты и смесь перемешивают. После этого в обе колбы дозирующей пипеткой приливают по 1 мл 1% раствора пероксида водорода, смеси перемешивают и помещают на 15 минут в термостатированную камеру при температуре 30°С. Реакция проводится в отсутствие света, который активизирует самопроиз-вольный распад пероксида водорода на кислород и воду. Отсчёт времени ферментной реакции начинается в тот момент, когда к ферментному раствору приливается раствор пероксида водорода. По истечении 15 минут теперь уже в колбу с активным ферментом для его инактивации приливается 5 мл 10% раствора серной кислоты и в этот момент фиксируется точное время прекращения ферментативной реакции.

Количество неразложившегося пероксида водорода в контрольной колбе и в колбе с активным ферементом определяется титрованием 0, 1 н раствором перманганата калия до получения слабо розового окрашивания, не исчезающего в течение одной минуты. Результаты титрования далее используются для расчёта активности определяемого фермента.

Обработка и оценка результатов. Активность каталазы рассчитывают по формуле:

(V₁ -V₂) ∙ 50 ∙ 20

А = ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾,

H ∙ 5 ∙ t

 

где А – активность каталазы в мккат в расчёте на 1 г растительной массы;

V₁ – количество раствора перманганата калия, затраченного на титрова-ние контроля (с инактивированным ферментом), мл;

V₂ – количество раствора перманганата калия, затраченного на титрова-ние пробы с активным ферментом, мл;

50 – коэффициент пересчёта мл 0, 1 н раствора перманганата калия в микромоли пероксида водорода;

20 – общий объём ферментного экстракта, полученного из навески растительного материала, мл;

Н – навеска растительного материала, г;

5 – объём ферментного экстракта, взятый для проведения фермента-тивной реакции, мл;

t – время ферментативной реакции в секундах.

Полученный показатель активности каталазы сравнивают с резуль-татами анализа других растительных образцов и дают оценку происходящих в них биохимических процессов.

Контрольные вопросы

1. Каковы общие принципы определения каталитической активности ферментов?

2. В каких единицах измеряется активность ферментов?

3. Какое значение для организмов имеет фермент каталаза?

4. Каковы принципы определения активности каталазы по методу А.Н. Баха и А.И. Опарина?

5. Как получают ферментный экстракт при определении активности каталазы?

6. Каковы особенности проведения реакции ферментного экстракта с раствором пероксида водорода?

7. Для чего нужен контрольный вариант при определении активности каталазы по методу А.Н. Баха и А.И. Опарина?

8. Как проводится титрование неразложившегося пероксида водорода раствором перманганата калия?

9. Как рассчитывают активность каталазы по результатам анализа?

10. Как используется показатель активности каталазы для оценки биохимических процессов, происходящих в растительной продукции?