Работа №3. Липаза является липолитическим ферментом, который расщепляет липиды на глицерол и жирные кислоты

 

ИЗУЧЕНИЕ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ЛИПАЗЫ.

 

Липаза является липолитическим ферментом, который расщепляет липиды на глицерол и жирные кислоты. Оптимальная температура для действия липазы – 37-38⁰С и слабощелочная среда. Активность липазы усиливается желчью, которая обладает способностью эмульгировать жиры, благодаря чему расширяется область действия этого фермента.

Цель: продемонстрировать роль желчи в обеспечении оптимального режима активности липазы поджелудочной железы.

Принцип действий: В пробирки вводят липазу и растительное масло и добавляют желчь. После инкубации исследуют рН. Снижение рН по сравнению с исходной доказывает появление жирных кислот в пробирке с желчью.

Рис. 29. Оборудование для изучения субстратной специфичности липазы

 

Прежде, чем начинать эксперимент, составьте план опыта. Вы можете максимально использовать 7 пробирок, в которых должны быть смешаны 4 реактива. Вы можете также менять время инкубации (максимально до 90 мин) и температуру в термостате.

Один из вариантов опыта:

Пробирка 1. Масло + липаза + желчь + рН 9.

Пробирка 2. Масло + липаза + вода + рН 9.

Пробирка 3. Масло + липаза + желчь + рН 7.

Пробирка 4. Масло + липаза + вода + рН 7.

Пробирка 5. Масло + липаза + желчь + рН 2.

Пробирка 6. Масло + липаза + вода + рН 2.

Алгоритм действий:

1. Перенести 1-ю пробирку из контейнера в штатив справа.

2. С помощью мышки налить в пробирку растительного масла и добавить липазы и желчи. Добавить буферный раствор рН 9.

3. Перенести 2-ю пробирку из контейнера в штатив. Налить в нее растительное масло, липазу и воду. Добавить буфер рН 9.

4. Повторяйте эти шаги, пока не заполните все пробирки согласно плану эксперимента.

Примечание: вы можете работать и с меньшим числом пробирок!

5. Установите необходимое время и нажмите «Incubate». После окончания инкубации откроется окно рН-метра.

6. С помощью мышки переместите первую пробирку в держатель рН-метра слева и нажмите «Измерить рН» (Measure pH).

7. Повторите эту процедуру с другими пробирками.

8. Нажмите Record data для регистрации результатов эксперимента в таблице.

9. Уберите пробирки в контейнер. Запишите полученные результаты в тетрадь и сделайте выводы.

Таблица 3. Субстратная специфичность липазы и роль желчи в расщеплении жиров.

№ пробирки	Субстрат	Фермент	Наличие желчи	рН исходная	ТоС	Время	рН конечная

Попробуйте ответить на следующие вопросы:

1) Какова роль желчи в гидролизе жиров? Чем вы можете доказать свое утверждение?

2) Докажите, что интенсивность гидролиза зависит от времени инкубации и рН среды.