Работа №2

ИЗУЧЕНИЕ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ПЕПСИНА.

 

Пепсин является протеолитическим ферментом, который синтезируется основными клетками желудочных желез в виде неактивного пепсиногена. Когда рН содержимого желудка становится ниже 5, пепсиноген превращается в пепсин. Происходит это благодаря присутствию с желудочном сока соляной кислоты. Наибольшую активность пепсин проявляет при рН 2.

Цель: продемонстрировать влияние уровня рН на активность пепсина.

Принцип действий: инкубирование в течение 3 часов пепсина и яичного белка при 38^оС вместе с соляной кислотой и без нее. Определение степени переваривания белка (по уменьшению его размеров).

Рис. 28. Оборудование для изучения субстратной специфичности пепсина

 

В набор реактивов для этого опыта входят пепсин, куриный белок (ВАРНА), вода и буферные растворы с рН 2, 7, 9.

Прежде, чем начинать эксперимент, составьте план опыта. Вы можете максимально использовать 7 пробирок, в которых должны быть смешаны 3 реактива. Вы можете также менять время инкубации (максимально до 90 мин) и температуру в термостате.

 

Один из вариантов опыта:

Пробирка 1. Белок + пепсин + рН 2.

Пробирка 2. Белок + пепсин + + рН 7.

Пробирка 3. Белок + пепсин + рН 9

Пробирка 4. Белок + вода + рН 2.

Пробирка 5. Белок + вода + рН 7.

Пробирка 6. Белок + вода + рН 9.

Пробирка 7. Пепсин + вода + рН 9.

Алгоритм действий:

1. Перенести 1-ю пробирку из контейнера в штатив справа.

2. С помощью мышки поместить в пробирку белок (ВАРНА) и добавить пепсин. Добавить буферный раствор рН 2.

3. Перенести 2-ю пробирку из контейнера в штатив. Налить в нее белок и пепсин. Добавить буфер рН 7.

4. Повторяйте эти шаги, пока не заполните все пробирки согласно плану эксперимента.

Примечание: вы можете работать и с меньшим числом пробирок!

5. Установите необходимое время и нажмите «Incubate». После окончания инкубации откроется окно спектрофотометра.

6. С помощью мышки переместите первую пробирку в держатель спектрофотометра слева и нажмите «Анализ». Показатель экстинции прибора прямо пропорционален концентрации аминокислот в растворе.

7. Повторите эту процедуру с другими пробирками.

8. Нажмите Record data для регистрации результатов эксперимента в таблице.

9. Уберите пробирки в контейнер. Запишите полученные результаты в тетрадь и сделайте выводы.

Таблица 2. Свойства пепсина и влияние рН на его активность

№ пробирки	Субстрат	Фермент	рН	время	ТоС	Показатель экстинции

 

1) При каком рН раствора и при какой температуре произошел наиболее активный гидролиз?