Анаэробты микрофлораны алу мақсатындағы себулер қатаң анаэробты жағдайда жасалады

Спора тү зуші анаэробты бактерияларды бө ліп аларда алғ ашқ ы себуді 80⁰С-тық су моншасында 20 минут бойы қ ыздырады, яғ ни бө где микрофлораның вегетативті жасушаларын жояды.

Бірінші себулерде байыту араларында /Китта-Тароцци, тиаглюколь/ жасайды, сонан соң Петри шынысындағ ы тығ ыз орталарғ а бө лектенген колониялар алу ү шін қ айта себеді. Қ антты қ ан агарына қ антты қ оректік тығ ыз агарының биік бағ ынасына Виньяль-Вейона, тә сілі бойынша егеміз. Бұ л тә сіл анаэроб ағ ындыларды ауадан механикалық жолмен сақ тауғ а негізделген. Егілген агарды стерильды /трубкағ а/ қ уыс ортағ а сорып алып бітеп тастайды. Осылай қ атаң анаэробтарғ а қ олайлы жағ дай жасаймыз.

Сабақ тың мазмұ ны:

З бетімен жасайтын жұ мыс.

1. Қ оректік орталармен танысып оларды жіктелуін мең геріп жазып алу.

2. Қ оректік орталарды дайындауды, стерильдеу жә не талаптарын мең геру.

3. Ә ртү рлі ә діс арқ ылы бактериальды қ оректік ортағ а егуді мең геріп хаттамағ а енгізу.

4. Бө лінген колонияларғ а дақ ылды бағ а беріп хаттамағ а енгізу.

5. Бө лінген колониялардан жұ қ па жасап болып, микроскопирлеп, бағ алап хаттамағ а енгізу.

Оқ ытушымен бірге жү ргізілетін жұ мыс:

1. Қ оректік орталарды дайың дау.

2. Қ оректік орталардың РН анық тау.

3. Ілмекпен, инемен, шпательмен қ оректік орталарғ а бактериаларғ а дақ ыл егу.

4. Ө скен колониялардан таза дақ ыл бө ліп алу ү шін тү тікшедегі қ иғ аш қ оректік ортағ а оқ шауланғ ан колонияны егу.

5. Оқ шауланғ ан колониядан дайындалғ ан жұ қ па препараттарды микроскопирлеп танып жауап беру.

Білім дең гейін тексеру жә не қ ортындылау.

Тестілер кітапша ретінде берілген.

Тақ ырып бойынша ситуациялық есептер:

1. Анаэробтардың таза дақ ылын бө ліп алу ү шін техникасында қ андай қ ателік жіберілді?

2. Шымкент қ аласында ішек инфекцияларының ө ршіген кезінде лабораторияда бір топ аурудан дизентерия, іш сү зегі, тырысқ ақ вибрионы бө ліп алынып талданғ ан. Бө лінген қ оздырғ ыштарды арнайы микробиологиялық терминдермен негіздең із.

Медициналық -латын терминологиясы:

1. Аутотроф - /грек, autos - ө зі, troph –тағ ам/

2. Гетеретроф - /грек, geteros - басқ а, troph - тағ ам/

3. Пермеаздар - ақ уыз тасмалдаушылар.

4. Транслокация - тасымалдау.

5. Анаболизм - синтез.

6. Катоболизм - ыдырау.

7. Индуцибельдік - шақ ыратын

8. Lag - кешігу.

9. Сапрофиттер - safros - шіру, phytos - ө сімдік.

10.Паразит - арамтамақ.

11.Фермент - /лат, fermentum - ашыту/ - биокатализатор.

 

Тақ ырыбы: Қ оректік орталар мен олардың классификациясы. Аэробтар жә не анаэробтардың таза дақ ылын алудың екінші жә не ү шінші этаптары.

Тақ ырыптың ө зектілігі: Қ оректік орталар, оларды стерилизациялау ерекшеліктерін білу, аэробты жә не анаэробты микробтардың дақ ылын бө ліп алуы, дақ ылдауы, бактериологиялық зерттеу тә сіліндегі ең маң ызды мқ селесі болып табылады.

Сабақ тың мақ саты: Қ оректік орталардың тү рлерін, маң ызын, тағ айындалуын зерттеу тә сілдерін аэробты жә не анаэробты микробтарды бө ліп алу ә дістерін мең геру.

Тақ ырып бойынша бақ ылау сұ рақ тары:

1. Қ оректік орталардың жіктелуі.

2. Қ оректік орталарғ а қ ойылатын талаптар.

3. Универсальды қ оректік орталар.

4. Элективті /селективті/ қ оректік орталар, оның тағ айындалуы.

5. Дифференциалды - диагностикалық қ оректік орталардың қ ұ рамы мен қ олданылуы.

6. Қ оректік орталарды стерильдеу ә дістері.

7. Идентификация не болмаса диагностика мақ станыда лабораториялық жағ дайда бактериялардың дақ ылдық қ асиеттерін анық тау.

8. Идентификация не болмаса диагностика мақ стыныда лабораториялық жағ дайда бактериялардың сахаролиттік ферменттерін анық тау.

9. Идентификация не болмаса диагностика мақ станыда лабораториялық жағ дайда бактериялардың протеолиттік ферменттерін анық тау.

10. Бактериялардың идентификациясы.

Қ осымша ақ парат:

Қ оректік орта дегеніміз - кү рделі жә не жай қ ұ рамдардың ә ртү рлі қ осылыстары болып келетін орталар. Оны лабораториялық жағ дайда бактериялар мен басқ а микроорганизмдерді кө бейітіп ө сіру ү шін қ олданылады.

Қ оректік ортаны жануардан немесе ө сімдіктен туындағ ан ө німдерден дайындайды. Қ оректік ортада ө су факторының болуы ү лкен маң ызғ а ие. Оларды дайындау ү шін экономикалық рентабельді тағ амдық емес шикізат қ олданылады: жарамсыз қ алғ ан қ ан алмастырушылар, жануар қ анының гидролизаты, аминопетиферментативті, қ ан гидролизаты, биотехнология ө німдері - жем ашытқ ылары, жемдік лизин, жү зім ұ нтағ ы, ақ уыз лизин. Синтетикалық орталардың қ ұ рамына химиялық таза заттар- аминқ ышқ ылдары, минералды тұ здар, кө мірсулар, витаминдер жә не ө сіру факторлары кіреді. Консистенциясы бойынша қ оректік орталар сұ йық, жартылай сұ йық, тығ ыз болып келеді.

Қ ұ рамы бойынша - табиғ и, синтетикалық жә не жартылай синтетикалық. Тағ айындалуы бойынша негізгі, элективті жә не дифференциалды -диагностикалы болып бө лінеді.

Қ оректік орта мына талаптарғ а сай болуы тиіс: бұ л жерде барлық қ оректік заттар жеткілікті болуы керек, тұ здар, ө су факторлары, микроорганизмнің ө суіне қ ажетті заттары жең іл сің імді тү рде болуы тиіс, оптимальды ылғ алдылығ ы, тұ тқ ырлығ ы, рН-ы оптимальды, стерильді болуы тиіс, мү мкіндігінше мө лдір жә не изотоникалы болуы тиіс. Бө где заттар болмауы тиіс. Ә рбір қ оректік ортаны қ ұ рамына қ арай ә ртү рлі ә діспен стерилизациялайды.

Универсальді (негізгі) - орталар, патогенді жә не патогенді емес бактериялардың барлық тү рлері ө сетін орта. Осы орталарғ а жататын: ет-пептонды сорпа (ЕПС), ет- пептонды агар (ЕПА).

Негізгі кү рделі орталар – қ анды, қ ан сарысулы жә не асциттік. Осы қ оректік орталарды дайындау ү шін 5-10%-ті дефибринделген қ ан не болмаса қ ан сарысуы, 25%- ті асциттік сұ ық тық тарды қ осады. Сұ йық қ оректік ортаны дайындау ү шін осы мө лшердегі қ ан сарысуын не болмаса асциттік сұ ық тарды қ осамыз.

Мюллер-Хинтон агары – негізгі тығ ыз қ оректік орта дискі ә дісімен бактериялардың антибиотиктерге сезімталдығ ын анық тау ү шін қ олданады.

Элективті /селективті/ қ оректік орталар ә ртү рлі бө где микрофлорасынан микроорганизмнің белгілі-бір тү рін таң дамалы тү рде бө ліп алып жинақ тау ү шін тағ айындалғ ан. Элективті қ оректік орталарғ а 1 пептон суы, рН- 8, 0 тең орта, сілтілі агар /тығ ыз орта/, қ оректік агар рН- 7, 8; Леффлер ортасы, УТА /уызды тұ зды агар/, Китта-Тароцци ортасы, Мюллер, селенит, Раппопорт т.б.

Дифференциальды-диагностикалы орталар қ айсы-бір микроорганизм тү рлерін олардың ферментативті жә не дақ ылдық қ асиеттері бойынша шектеуге қ олданады. Оның қ ұ рамына мына компоненттер кіреді: негізгі қ оректік орта - бактерияның ө суін қ амтамасыз етеді, белгілі бір кө мір-қ ышқ ылы, тү рлі-тү сті индикатор. Дифференциалды-диагностикалы орталарғ а Гисс, Рессел, Эндо, Плоскирев, висмут-сульфат агары ортасы жатады.

Қ оректік орталарды келесі ә діспен стерильдейді:

1) Жоғ арғ ы қ ысымдағ ы бу арқ ылы /автоклавта/ стерильдеу.

2) Кох аппараты жә не автоклав арқ ылы ағ ынды бумен стерильдеу.

3) Механикалық стерильдеу /фильтрлеу/.

Орталадың стерильдігін бақ ылау ү шін 37⁰С-та 5 тә улікке термостатқ а қ оямыз. Сұ йық қ оректік орталар мө лдір болуы тиіс, ал тығ ыз қ оректік орталардың беткейінде ө су белгілерінің болмауы тиіс

Бактерияларды ө сіру ү шін келесі дақ ылдау тә сілдерін қ олданады:

1. Стационарлы тә сіл: қ оректік орталар қ алыпты сақ талады. Олармен ешқ андай қ осымша манипуляция жү ргізбейміз. Осылай сұ йық қ оректік орталарда дақ ылдау тә сілінде биомассаның шығ ып кетуі шамалы.

2. Терең ге аэрациялық дақ ылдау ә дісі: осы тә сіл арқ ылы дақ ылдағ ан кезде арнайы қ ұ рылым реактерді қ олданады. Бұ л жерде қ алыпты температура, оптимальды рН, керекті қ оректік заттың мө лшерлі тү суі бір қ алыпты болады. Олар ә рдайым стерильді ауамен желденіп тұ рады, орта ә рдайым араласып тұ ру ү шін араластырғ ыш орналастырылғ ан. Осы ерекшеліктерге байланысты биомассаның максимальды шығ уын қ амтамасыз етеді.

Анаэростат микроорганизмдерді анаэробты жағ дайда ө сіруге тағ айындалғ ан. Хемостат - бұ л аппаратта ә рдайым ерекше резервуардан жаң а қ оректік орта қ осылып тұ рады. Турбистаттың жұ мысының принципі аппараттағ ы бактериальды популяциясының тығ ыздығ ын сақ тап тұ руғ а негізделген. Осы аппараттарда ортаның ө згермей сақ тауының арқ асында, ү зіліссіз дақ ыл керекті фазада болып тұ рады. Ол маң ызды биологиялық қ осылыстарының яғ ни биомассаның максимальды шығ уы қ амтамасыз етеді.

Анаэробты микрофлораны алу мақ сатындағ ы себулер қ атаң анаэробты жағ дайда жасалады. Спора тү зуші анаэробты бактерияларды бө ліп оларды алғ ашқ ы себуді 80^оС-тық су моншасында 20 минут бойы қ ыздырады, яғ ни бө где микрофлораның вегетативті жасушаларын қ ояды.

Спора тү зуші анаэробты бактерияларды бө ліп аларда алғ ашқ ы себуді 80^оС-тық су моншасында 20 минут бойы қ ыздырады, яғ ни бө где микрофлораның вегетативті жасушаларын жояды.

Бірінші себулерде байыту араларында /Китта-Тароцци, тиаглюкол/ жасайды, сонан соң Петри шынысындағ ы тығ ыз орталарғ а бө лектенген колониялар алу ү шін қ айта себеді. Қ антты қ ан агарына қ антты қ оректік тығ ыз агарының биік бағ ынасына Виньяль-Вейона, тә сілі бойынша егеміз. Бұ л тә сіл анаэроб ағ ындыларды ауадан механикалық жолмен сақ тауғ а негізделген. Егілген агарды стерильды /трубкағ а/ қ уыс ортағ а сорып алып бітеп тастайды. Осылай қ атаң анаэробтарғ а қ олайлы жағ дай жасаймыз. Анаэробты бактерияларды дақ ылдау ү шін физикалық жә не химимялық, биологиялық ә дістерді қ олданады.

Физикалық ә дістер:

1) Редукциялаушы жә не жең іл тотығ атын заттар бар ортағ а егу.

2) Микробты тығ ыз қ оректік ортаның терең қ ойнауына егу.

3) Тү тікшелерден ауаны механикалық жолмен щығ ару. Тү тікшелердегі ауаны қ андай да бір интерферентті химиялық газбен /пирагален, натрий гидросульфат/ алмастыру.

Биологиялық ә дістер анаэробтарды қ атаң аэробтармен бірге ө сіруге негізделген. Химиялық ә діс ауаны / Na S₂O₄ / сің ірілуге негізделген.

Комбинирленген ә діс физикалық, химиялық, биологиялық тә сілдерді қ осып қ олданғ анғ а негізделген.

Колониялар. Тығ ыз қ оректік ортада бактериялар колония тү зеді. Олардың сыртқ ы кө рінісі қ айсыбір бактериялар ү шін дифференциалды белгі ретінде қ арастырылады. Колониялар ө лшемі, пішіні, тү сі, консистенциясы, шеттік контуры, қ ұ рылымы жә не беткейлік сипаты бойынша ажыратады.

Колониялар мө лшері бойынша ірі /4-5мм/, орташа /2-4мм/ жә не ұ зақ /1-2мм/. Пішіні бойынша домалақ, резетка тә різді, жапырақ тә різдес болады. Тү сі бө лінген пигменттерге байланысты ақ, сары, қ ызыл т.б. болады.

Консистенция бойынша қ ұ рғ ақ, ылғ ал, маң ызды немесе кілегейлі колония болады. Колониялардың беттері тегіс, ә жімді, сызылғ ан, жалпақ, дө нес басылғ ан. Колониялардың ішкі қ ұ рылымы аморфты, дә некті жіптер тә різді болуы мү мкін. Сұ йық қ оректік орталарда кейбір бактерия дақ ылдары мыналармен белгіленеді, диффузды лайлану, кейбіреулері тү біне немесе қ абырғ ағ а ө сумен, бетінде қ абық ша пайда болу, кейбіреулері пробирканың тү бінде тұ нба тү зеді.

Бактериялардың биохимиялық қ асиеттерін зерттеу: систематикасында классификациясында, идентификациясында, диагностикасында кең інен қ олданады. Дифференциалды диагностикалық орталарда бактериалардың сахаролиттік жә не протеолиттік ферменттерін анық тау таксономиалық маң ызғ а ие. Сахаролиттік қ асиетін анық тау ү шін Гисс ортасына егеміз (қ ысқ а жә не ұ зын ө шұ барң қ атар). Егерде бактериалар кө мірсуларды қ ышқ ылғ а дейін ферменттесе ортаның тү сі ө згереді, кө мірсулар қ ышқ ылғ а дейін ыдырап, газ тү зетін болса, тү сі ө згеруімен қ атар попловокта кө піршіктер пайда болады.

Протеолитикалық ферментті анық тау ү шін бактерия дақ ылын 10-20%- ті желатин, пептонды суы бар бағ анағ а ине шаншу арқ ылы егеміз. Желатиндегі егіндіні бірнеше кү н бойы 20-22^оС- та инкубациялаймыз.

Бактериялардың протеолитикалық ферменттері бар болса желатинді ыдыратып, осы жерде воронка не болмаса шырша тә різді фигура пайда болады. Пептонды судағ ы егіндідегі пептон ө німдері ыдырағ анан соң 37^оС-та 23 тә уліктен кейін аммиакқ а, индолғ а, кү кіртті- сутекке, каталазаны табу ү шін реакция қ ояды.

Аммиакқ а реакция. Лакмусты қ ағ аздың жің ішке жолағ ын қ оректік ортағ а тигізбей пробиркағ а бекітеді. Қ ағ аздың кө к тү ске ө згеруі аммиактың тү зілуін кө рсетеді.

Индолғ а реакция. Эрлик тә сілі: бактерия дақ ылы бар пробиркағ а 2-3 мл эфирді қ осамыз, Эрлих реактивінен біренеше тамшыны тамызып, аралыстырамыз. Индол тү зілетін болса тү сі бозғ ылт тү ске боялады не болмаса бозғ ылт сақ ина тү седі.

Кү кіртті сутекке раекция. Пептонды суы бар пробиркағ а темір сульфатына малынғ ан фильтр қ ағ азы жолағ ын қ оректік ортағ а тигізбей тығ ынмен бірге бекітеді. Кү кіртті сутекті ө ндіргенде темір сульфиді тү зіліп қ ағ аз қ ара тү ске боялады.

Каталазаны табу. Зат шынысының бетіне 1-3% сутегінің асқ ын тотығ ының 1 тамшысын тамызып бактериялды дақ ылы бар ілмекті орналастырамыз. Каталаза сутегінің асқ ын тотығ ын оттегімен суғ а ыдыратады. Газды кө піршіктердің шығ уы берілген бактерия тү рінің каталазаны тү зуімен сипатталады.

Идентификация – микроорганизмдердің тү рлік (қ ұ рамын) анық тау. Қ азіргі кезде идентификациялау ә дісі зерттелетін микроорганизмдердің белгілі бір фенотиптік белгілері жиынтығ ын анық тауғ а негізделген.

Бактериялардың негізгі тү рлік белгілеріне жататындар:

1. Микробтық жасушалық морфологиясы;

2. Тинкториалдық қ асиеті- қ арапайым жә не кү рделі бояу ә дістері арқ ылы боялу ерекшеліктері;

3. Дақ ылдық белгілері-қ оректік орталардағ ы ө су ерекшектері;

4. Биохимиялық белгілері- бактерия ферменттерінің болуы.

Идентификацияда қ олданылатын қ осымша белгілерге жататындар:

1. Тү рарнайы антигендердің болуы;

2. Тү рсепцификалық бактерифагтарғ а сезімталдығ ы;

3. Белгілі бір антимикробты препараттарғ а тү рлік резистентілігі.

4. Патогенді бактерияларғ а- белгілі вирулентті факторлардың ө німдері.

Соң ғ ы жылдары жанама биохимиялық молекулярлы - биологиялық идентификация ә дістері қ олданыла бастады: хемоидентификация, нуклеин қ ышқ ылдарының анализі, рестрикционды анализ, гибридизация, полимеризациялық тізбекті реакция (ПЦР) риботиптеу жә не т.б.