Зертханалық жұмыс. Титрациялық әдіспен топырақтағы ішек таяқшалары тобындағы бактерияларды анықтау

1. Топырақ ү лгілерін таң дап алу

Ә детте ү лгілерді бір жерден, тпоырақ бетінен (0 - 1 см) залалсыздандырылғ ан қ ұ ралдармен (пышақ, шпатель) 0, 3 - 0, 5 кг мө лшерінде алады. Алынғ ан ү лгілерді залалсыздандырылғ ан ыдыстарғ а салып, зертханағ а алып келеді. Егер ү лгіні сол ауақ ыт аралығ ында зерттеу мү мкіндігі болмаса, онда 4 - 5°С температурада 24 сағ ат қ ана сақ тауғ а болады.

 

2. Сараптамағ а топырақ ты таң дап алу жә не дайындау

Кө лемі 0, 5 кг болатын орташа ү лгіні дайындау ү шін бір телімнің топырақ тарының барлық ү лгісін залалсыздандырылғ ан қ ағ аз бетіне тө гіп, залалсыздандырылғ ан шпательмен мұ қ ият араластырады да, тастарды жә не басқ а қ атты заттардан тазартады.

Егер алдында топырақ ты диспергирлейді. Осы мақ сатта топырақ ты тазалық жағ дайларын сақ тай отырып, диаметрі 3мм болатын елеуішпен елейді. Елеу кезінде елеуіш бетін залалсыздандырылғ ан қ ағ азбен жауып қ ою керек. Шірімеген ө сімдік массасын алып тастайды.

Тпоырақ микоорганизмдері мен энтеровирустарды анық тау ү шін 1-ден 10 г дейін, санитарлық -кө рсеткіштік микроорганизмдер ү шін 1-ден 30 г дейін, ал патогенді энтеробактерияларды анық тауғ а 50 - 55, 5 г ө лшеме қ ажет.

Топырақ ты алдын – ала ө ң деудегі негізгі мақ сат топырақ агрегаттарынан микроорганизмдер клеткасын бө ліп алу болып табылады. Ол топырақ бө ліктерінің бетінен микроорганизмдердің десорбциялануымен жә не реттіліктің бұ зылуымен жү зеге асады. Топырақ ты алдын – ала ө ң деудегі негізгі ә дістері:

1) топырақ ө лшемі 1 г болатын, резең ке тығ ыны бар пробиркалардағ ы алғ ашқ ы сұ йылту суспензиясын 10-минут тігінен шайқ ау; вертикальное встряхивание почвенной суспензии первого разведения в пробирках с резиновыми пробками - при навеске почвы

2) 1 г жоғ ары топырақ ө лшемі бар, алғ ашқ ы сұ йылту суспензиясын араластырғ ышта 3 минут ө ң деу.

1 мл-де 0, 1 г топырақ болатын, алынғ ан суспензияны алдын – ала ө ң делгеннен соң 30 секундтан кейін (осы уақ ыт ішінде ү лкен минералды бө лшектер тұ нба болып тү седі). топырақ тың жү йелі кемімелі концентрациясын алу ү шін пайдаланады.

Топырақ ө лшемінің алғ ашқ ы сұ йылтуын (1: 10) залалсыздандырылғ ан ыдыста топырақ салмағ ымен 1: 10 қ атынасында залалсыздандырылғ ан қ ұ быр суын қ осып дайындайды (мысалы: 1 г топырақ ты 10 мл залалсыздандырылғ ан қ ұ быр суында, 10 г топырақ ты – 100 мл суда дайындайды). Ө лшемді дайындап алғ аннан кейін алынғ ан микроорганизм тү рі мен типіне байланысты сә йкес келетін топырақ тың алдын – ала ө ң деуін жү ргізеді. Ол ү шін қ ұ рамында 0, 1 г/мл топырақ болатын флакондағ ы алғ ашқ ы сұ йылтудан залалсыздандырылғ ан тамшуырмен 1 мл алып, оны 9 мл залалсыздандырылғ ан қ ұ быр суы бар пробиркағ а енгізеді. Сонымен қ атар, қ ұ рамында 0, 01 г/мл топырақ болатын екінші сұ йылтуды дайындайды. Осы операцияны қ айталап отырып топырақ сұ йылтуын 0, 0001 - 0, 00001 г/мл жеткізеді. Сұ йылту дайындағ анда оның ә рқ айсысына жеке тамшуыр қ олдану қ ажет.

Дайын болғ ан децимальды сұ йылтуларды тү рлі қ оректік орталарғ а топырақ ты егуде пайдаланады. Сонымен қ атар, тікелей микроскоптау ә дісімен микроорганизмдер санын анық тауда пайдаланылады.

Салыстыруғ а келетін жә не едә уір толық нә тижелер алу ү шін ә бден қ ұ рғ ағ ан 1 г топырақ та кездесетін микроорганизмдер санын қ айталап есептеп отыру талап етіледі. Ол ү шін топырақ тың зерттелетін ү лгісіндегі ылғ алдылық ты анық тап алу қ ажет. Осы мақ сатта топырақ ө лшемін (10 - 20 г) алдын – ала ө лшенген шыны немесе метал бюксқ а салып, 105°C болатын кептіргіш шкафта кептіреміз. Кепкен топырақ тан алғ ашқ ы бақ ылау ү шін ө лшеуді 3 сағ аттан кейін жү ргізеді (ә рбір 2 сағ ат сайын бақ ылау ө лшеу жү ргізеді). Есептеу келесідей формула бойынша жү ргізіледі:

 

Nc x 100%

N = --------- Nc = n x а,

100% - C%

Мұ ндағ ы,

N – ә бден қ ұ рғ ағ ан 1 г топырақ тағ ы клеткалар саны;

Nc – ө ң делмеген 1 г топырақ тағ ы леткалары саны;

а – он реттік сұ йылту дә режесі;

n – табақ шада ө сіп шық қ ан колониялар саны (барлық табақ шадан орташа арифметикалық саны алынады);

C – зерттелетін топырақ тың ылғ алдылығ ы (%).

 

3. Титрациялық (ашыту) ә дісімен ІТТБ анық тау

Коли-титр – ІТТБ табылатын топырақ тың ең аз саны (г). Коли-индекс – зертелетін 1 г топырақ тағ ы ІТТБ саны. Бұ л кө рсеткіштерді екі этаптан тұ ратын ашыту (титрациялық) ә дісімен немесе мембраналық фильтрлер ә дісімен анық талады.

Фекальді ластанудың орташа дә режесі болжанғ ан топырақ қ а санитарлық – микробиологиялық сараптау жү ргізу ү шін ІТТБ анық тауды титрациялық (ашыту) ә дісін қ олдану мақ ұ лданғ ан. Ашыту ә дісі зерттелетін топырақ тың арнайы сұ йылтуларын егу мен бактерияларды Эндо қ атты ортағ а қ айталап егілетіндей жинақ таушы ортада 37°С-та ө сіруге негізделген. Коли-титрді анық тау ү шін топырақ суспензиясының ә ртү рлі сұ йылтуларын дайындайды (10^-3 и 10^-6 ). 5 мл Кесслер ортасы мен тү бінде қ алтқ ысы бар пробиркаларғ а 1 мл-ден егіп, 37°С температурада 24-48 сағ ат бойы инкубациялайды. Флакондар мен пробиркалардағ ы орта лайланбай жә не қ ышқ ыл мен газ тү зілмесе, нә тижені теріс деп, зерттеуді аяқ тайды.

Лайланғ ан жә не ұ ышұ ыл мен газ тү зілген пробиркалар мен флакондардың ә рқ айсысынан, алып 3-4 секторғ а бө лінген Эндо ортасының ү стіне тұ зақ пен егу жү ргізеді. Егілетін материаларды изоляцияланғ ан колониялар алу есебімен таң дау қ ажет. Табақ шаларды 37°С температурада 16-18 сағ ат бойы инкубациялайды.

Ө су болмай, ішек таяқ шалары тобының бактерияларына тә н емес сипаттамалар болса, нә тижені теріс деп есептейді.

Эндо ортада ө сіп шық қ ан қ ызыл, қ ызғ ылт, ашық қ ызғ ылт, метал жылтыры болатын не болмайтын колониялардан (лактоза оң колониялардан) жұ ғ ынды дайындайды. Грам бойынша бояп, топырақ та болатын оксидаза оң бактериялар мен Pseudomonadaceae тұ қ ымдасының грамтеріс бактерияларынан ІТТБ диффиренцациялауғ а мү мкіндік беретіноксидазалық тесті жү ргізеді. Осы мақ сатта қ оректік орта бетінен шыны таяқ шамен 2 -3 изоляцияланғ ан колонияларды іліп алып, диметил- n-фенилендиаминмен шайылғ ан фильтр қ ағ азына штрих арқ ылы жағ ып шығ ады. Теріс оксидазалық тестте қ ағ аз тү сі ө згеріссіз қ алады, ал оң болатын болса, қ ағ аз 1 минут ішінде кө к тү ске боялады..

Жұ ғ ындыларда грамтеріс таяқ шалар мен оксидазалық тестің теріс болуы, ІТТБ болатындығ ын жылдам кө рсететін оң жауап алуғ а мү мкіндік береді. Сараптаманың нә тижесін коли-титрмен кө рсетеді.

Аз ластанғ ан топырақ тарды жылдам сараптау ә дістері ретінде мембраналық фильтр ә дісін қ олдану ұ сынылады. Ластанғ ан топырақ тарды сараптау кезінде Эндо ортасына 0, 1-0, 5 мл топырақ супензиясын тікелей беттік егу жү ргізуге болады (10^-2 дейін сұ йылту дайындайды).

Жоғ ары дә режелі фекальді ластанғ ан ү лгілерді сараптауда Эндо ортасына 0, 1-0, 5 мл мө лшерде топырақ суспензияларын тікелей беттік егу жасалады.