Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского-Шульгина-Брида)

 

Этот метод применяется в различных модификациях для определения численности микроорганизмов в разнообразных естественных субстратах – почве, загрязненной воде, оптически непрозрачных средах. Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках сводится к тому, что в определенном объеме исследуемой суспензии непосредственно под микроскопом подсчитывают количество клеток микроорганизмов. Использование фиксированных мазков дает возможность сохранять препараты длительный срок и проводить подсчет не по ходу опыта, а в удобное для исследователя время.

Приготовление препарата: 0, 01 мл (либо от 0, 02 до 0, 05 мл) исходной суспензии почвы (1: 10²) либо других разведений наносят на чистое и обезжиренное предметное стекло. В некоторых случаях добавляют каплю 0, 03–0, 1%-го водного раствора агара. Суспензию распределяют с помощью бактериальной петли равномерно на площади в 4–6 см² (можно под стекло положить миллиметровую бумагу с хорошо очерченным квадратом). После просушивания препарат фиксируют 10–20 мин 96%-ным спиртом. Красят карболовым раствором эритрозина в течение 20–30 мин. Для этого стекло помещают в стакан с красителем. Можно прокрасить другими красителями в течение 5 мин. Затем окрашенные препараты осторожно промывают (желательно погружением стекла в 4–5 сосудов с водой) и высушивают.

Правила подсчета. Подсчет клеток микроорганизмов проводят с иммерсионным объективом в квадратах окулярной сетки, которую вставляют в окуляр. Просчитывают 50–100 квадратов сетки (не менее 10 полей зрения, а для получения достоверных результатов – не менее 100 полей зрения), передвигая препарат по диагонали. При отсутствии окулярной сетки можно подсчитывать клетки микроорганизмов на всей площади поля зрения микроскопа.

Количество клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 мл (1 г) исследуемого материала, вычисляют по формуле:

 

где М – количество клеток в 1 мл; А – среднее число клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения); s и S – площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения) и приготовленного мазка в мкм², соответственно; V – объем нанесенной на стекло суспензии в мл; n – разведение исследуемого материала.

Площадь квадрата сетки, или поля зрения, определяют с помощью объект-микрометра, который помещают на столик микроскопа вместо препарата, и при том же увеличении, при котором проводили подсчет, определяют сторону квадрата окулярной сетки или диаметр поля зрения. Площадь поля зрения вычисляют по формуле S = π х r².

Пример пересчета: если площадь окулярной сетки равна 0, 04 мм² , то на площади препарата, равной 4 см², площадь окулярной сетки поместится 10 000 раз и, если на площади сетки было в среднем 10 бактериальных клеток, то в препарате будет 10 000 х 10 = 100 000 клеток. На площадь в 4 см² было нанесено 0, 01 мл почвенной суспензии разведения 1: 10² или 0, 0001 г почвы. Следовательно, в 1 г почвы содержится 100 000 х 10 000 = 1 000 000 000 микробных клеток.