Сопряженный ферментный анализ

В предыдущем примере оценка ферментативной активности основывалась на измерении скорости образования продукта (NADH). Скорость образования продукта (или, реже, скорость расходования

Рис. 7.5. Принцип измерения активности NADH- или -зависимой дегидрогеназы. Измеряют скорость изменения оптической плотности при 340 нм, обусловленного превращением восстановленного кофермента в окисленную форму. В кювету добавляют окисленный субстрат (S). восстановленный кофермент и буфер и регистрируют поглощение при 340 нм. Вначале наблюдается высокая оптическая плотность из-за сильного поглощения NADH (или NADPH). При добавлении стандартною раствора фермента оптическая плотность понижается.

Рис. 7.6. Калибровочная кривая для определения количества фермента. По оси ординат отложен тангенс угла наклона прямых, приведенных на рис. 7 5, по оси абсцисс — количество фермента

субстрата) можно использовать для определения активности не только дегидрогеназ, но и других ферментов. Конкретный метод количественной оценки диктуется физико-химическими свойствами продукта или субстрата. Во многих случаях бывает удобно подвергать образовавшийся продукт реакции действию дегидрогеназы, для которой этот продукт является субстратом (рис. 7.7).

Рис. 7.7. Определение активности гексокиназы в системе, в которой протекает сопряженная ферментативная реакция, катализируемая глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глюкоза, АТР, Mg2+ и NADP+ добавлены в избытке. В этих условиях скорость общей сопряженной реакции зависит от количества добавленной гексокиназы. Эту скорость определяют по образованию NADPH, который поглощает свет при 340 нм.