Энзимодиагностика

До недавнего времени ферменты служили лишь объектом исследования в клинической биохимии, и лишь сравнительно недавно они стали использоваться, как аналитические реагенты, то есть как реактивы для количественного определения других веществ.

Преимущества ферментативных методов исследования: высокая точность, специфичность (в силу специфичности используемых ферментов), чувствительность. К этим «трем китам», на которых стоят ферментативные методы, следует добавить простоту проведения анализа, значительное сокращение времени исследования и, часто, отсутствие необходимости построения калибровочных графиков. Приведем важнейшие ферментативные методы исследования.

На использовании в качестве индикаторного фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Гл.6.Ф.ДГ) основан самый точный из всех существующих метод определения глюкозы. Здесь реакция идет по схеме:

 

Глюкоза + АТФ ^{гексокиназа} глюкозо-6-фосфат + АТФ

 

Глюкозо-6-фосфат + НАДФ^{+ Гл.6.Ф.ДГ.} 6-фосфоглюконат + НАДФН.Н⁺

 

Глюкоза при участии гексокиназы фосфорилируется в глюкозо-6-фосфат, который с помощью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы окисляется в 6-фосфоглюконовую кислоту. Эта реакция сопровождается накоплением НАДФН.Н+ и, следовательно, возрастанием оптической плотности при 340 нм.

Другой подход к определению глюкозы основан на использовании сопряженной системы глюкозооксидаза + пероксидаза и более широко известен. При участии глюкозооксидазы глюкоза окисляется кислородом воздуха с образованием перекиси водорода, количество которой определяется по ее способности в присутствии пероксидазы окислять диамины с образованием окрашенных продуктов:

 

Глюкоза + О₂ + Н₂О ^{глюкозооксидаза} глюконовая кислота + Н₂О₂

 

Н₂О₂ + краситель ^{пероксидаза} окрашенный продукт + Н₂О

 

В качестве красителей (индикаторов) для пероксидазной реакции предложена целая группа веществ: о-толидин, о-дианизидин, фенол + 4-амино-антипирин и др.

Эта же пероксидазная реакция с участием 4-амино-антипирина может быть использована для количественного определения холестерина и триглицеридов.

При определении холестерина его эфиры гидролизуются холестеролэстеразой до свободных жирных кислот и холестерина, который под воздействием холестеролоксидазы окисляется кислородом воздуха до 4-холестерола. Образующаяся при этом перекись водорода в присутствии пероксидазы окисляет вещества – индикаторы с образованием окрашенных соединений, интенсивность окраски которых пропорциональна содержанию холестерина в исследуемом образце:

 

Эфиры холестерина ^{холестеролэстераза} холестерин + R-COOH

 

Холестерин + О₂ ^{холестеролоксидазы} D⁴ -холестенон + Н₂О₂

 

2Н₂О₂ + 4-амино-антипирин + фенол ^{пероксидаза} окрашенный продукт + 4Н₂О

 

Описанный метод определения холестерина является самым точным из ныне существующих. В реакции Либермана-Бурхарда, рутинном методе определения холестерина, участвуют и другие стерины, что приводит к завышенным результатам. К другим преимуществам ферментативного метода следует отнести отсутствие влияния примесей билирубина и гемоглобина, необходимости проводить длительный гидролиз эфиров и экстракцию холестерина, отсутствие агрессивных реагентов.

Еще более сложная ферментная система может быть использована для определения триглицеридов. Триглицериды расщепляются липазой до жирных кислот и глицерина, который при участии глицерокиназы и АТФ фосфорилируется с образованием глицерол-3-фосфата. Глицерол-3-фосфат в присутствии глицерофосфатоксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием фосфодиоксиацетона и перекиси кислорода, которая в свою очередь окисляет краситель с образованием окрашенного комплекса, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации триглицеридов в исследуемом образце.

 

Триглицерид + 3 Н₂О ^липаза глицерин + 3 R-СООН

 

Глицерин + АТФ ^{глицерокиназа} глицерол - 3 фосфат + АТФ

 

Глицерол - 3 фосфат + О₂ ^{глицеролфосфат} фосфодиоксиацетон + Н₂О₂

^{оксидаза}

 

Н₂О₂ + 4 - аминоантипирин + 4 - хлорфенол ^{пероксидаза}

окрашенный комплекс + 2Н₂О + НСl

 

Этот метод определения триглицеридов наиболее специфичен, исключительно точен и чрезвычайно прост в исполнении.

В настоящее время разработана целая группа ферментативных методов определения мочевой кислоты. Первым этапом этих методов является расщепление мочевой кислоты уриказой до аллантоина, углекислоты и перекиси водорода:

 

Мочевая кислота + 2 Н₂О + О₂ ^{уриказа} аллантоин + СО₂ + Н₂О₂.

 

Образовавшаяся перекись водорода может быть определена разными способами:

1) По реакции с 4- аминоантипирином или другим аналогичным

красителем

2) Превращением метанола с участием каталазы в формальдегид, который определяется специальными методами.

3) Окислением перекисью этанола в ацетатальдегид, который затем восстанавливается НАДH.H+ (оптический тест Варбурга).

Следует отметить высокую специфичность всех ферментативных методов определения мочевой кислоты по сравнению с рутинными фосфорновольфрамовыми методами т. к. кроме мочевой кислоты фосфорновольфрамовую кислоту восстанавливает аскорбиновая кислота, тирозин, триптофан, цистин, цистеин и др.

Еще большее количество методов предложено для ферментативного определения мочевины. Первым этапом всех этих методов является расщепление мочевины уреазой до аммиака и углекислоты:

 

Мочевина + Н₂О ^уреаза 2NH₄⁺ + CО₂

 

 

Определение ионов аммония может быть осуществлено разными способами:

1) классической Бертолетовой реакцией

2) модифицированной Бертолетовой реакцией с салицилатом натрия

3) с помощью оптического теста Варбурга

В последнем случае в качестве индикаторной служит реакция:

 

NH⁺ + a-кетоглутарат + НАДН ^{глутаматдегидрогеназа} глутамат + НАД⁺ + 2 Н₂О

 

Все эти методы высокоспецифичны, т. к. для уреазы мочевина является единственным физиологическим субстратом, но наиболее точным является метод с оптическим методом Варбурга.

В заключение следует сказать о новом направлении в использовании ферментов: ферментативных методах определения электролитов (К+, Nа+, Сl+). Эти методы основаны на способности электролитов оказывать активирующее влияние на активность некоторых ферментов.