Свободноживущие и симбиотические азотфиксаторыСемейства Azotobacteriaceae и Rhizobiaceae Процесс фиксации азота – это в основном биологический процесс, и единственными организмами, способными его осуществлять, являются бактерии. Азотфиксирующие микроорганизмы имеют ферментный комплекс – нитрогеназу, активирующий инертную молекулу атмосферного азота, имеющую тройную связь между атомами азота N=N. Процесс восстановления молекулы азота до аммиака требует затраты больших количеств энергии и идет через ряд промежуточных продуктов. Образование нитрогеназы связано с наличием в клетках азотфиксирующих микроорганизмов nif-плазмиды, содержащей nif-ген, регулирующий синтез этого белка. Русский учёный Сергей Николаевич Виноградский впервые (1893) выделил из почвы анаэробную спороносную бактерию Clostridium Pasteurianum, усваивающую молекулярный азот. Биологическая фиксация азота в природе осуществляется свободноживущими и симбиотическими бактериями. К наиболее важным свободноживущим азотфиксирующим микроорганизмам, осуществляющим не симбиотическую фиксацию азота, относятся цианобактерии (Anabaena и Nostoc), Azotobacter, Beijerinckia, Bacillus polymyxa, Clostridium и другие. Микроорганизмами, способными к симбиотической фиксации азота, являются бактерии семейства Rhizobiaceae рода Rhizobium.
Семейство Azotobacteriaceae Семейство объединяет свободноживущие азотфиксирующие бактерии, отнесенные к группе 4 определителя Берджи (1997). Это представители нескольких родов: Azotobacter, Azomonas, Agromonas, Beijerinckia, Derxia. Это крупные палочковидные клетки, неспорообразующие, облигатные аэробы, хемоорганогетеротрофы, обитатели воды, почвы и поверхности растений, главной особенностью которых является способность фиксировать молекулярный азот. Бактерии рода Azotobacter относятся к свободноживущим микроорганизмам, способным фиксировать молекулярный азот. В молодой культуре это крупные, подвижные, палочковидные, овальные или кокковидные клетки, располагающиеся попарно либо в коротких цепочках из четырех и более клеток, объединенных макрокапсулой. С возрастом клетки меняют форму, превращаясь в крупные кокки, часто соединенные попарно и имеющие общую капсулу. В старых культурах характерно образование цист. На плотных питательных средах колонии азотобактерий имеют характерный слизистый вид из-за образующегося в большом количестве внеклеточного полисахарида. Некоторые штаммы синтезируют флуоресцирующий водорастворимый пигмент. Все виды – аэробы. Хемоорганотрофы. В качестве источника азота могут использовать аммонийные соли, нитраты, нитриты и аминокислоты, в их отсутствие фиксируют молекулярный азот. Используют для питания многие источники углеродного питания: миносахара, дисахариды, некоторые полисахариды (крахмал), различные спирты, органические кислоты. Азотобактер очень требователен к субстрату, реагирует на дефицит кальция и фосфора, не выносит кислой среды и более влаголюбив, чем другие почвенные бактерии. Типовой вид рода – Azotobacter chroococcum. Для него характерно образование водорастворимого темного пигмента – меланина, который окрашивает колонии в бурый, почти черный цвет. Для накопления свободноживущих азотфиксаторов используют специальную среду Эшби, не содержащую минеральных и органических источников азота. Среду разливают в колбы слоем 1-1,5 см, делают посев из почвы и инкубируют при температуре 28-30 оС. Через 5-7 суток на поверхности среды образуется жирная пленка, сначала серовато-белая, а затем постепенно буреющая. Микроскопируя пленку, можно обнаружить клетки азотфиксирующих бактерий. Выявляют капсулу методом негативного контрастирования. Для этого каплю исследуемой культуры помещают в каплю разбавленного фуксина, а затем смешивают с каплей туши и закрывают покровным стеклом. Тушь заполняет пространство, окружающее клетки, в результате чего хорошо видны не окрашивающиеся капсулы.
|
