Электронная микроскопия

Просвечивающая электронная микроскопия тонких срезов миелина, а фактически и всех остальных мембран, выявляет характерную трехслойную структуру, состоящую из двух электроноплотных полос, разделенных промежутком около 80 А. Такая картина получается в значительной мере в результате обработки препаратов четырехокисью осмия, обычно применяемой в этом методе. Робертсон назвал наблюдаемую структуру "унитарной", чтобы подчеркнуть ее универсальность, и хотя молекулярные механизмы прокрашивания мембран осмием неизвестны, эта структура рассматривалась как подтверждение справедливости бислойной модели мембраны. Ясно, однако, что при подготовке препаратов для просвечивающей электронной микроскопии мембраны могут подвергаться неблагоприятным воздействиям. В частности, известно, что обработка четырехокисью осмия приводит к значительной потере белка из эритроцитарной мембраны. И хотя наблюдаемая при этом трехслойная структура в некоторой степени отражает организацию бислойных мембран, более детальные сведения относительно локализации белков этим методом получить не удается.

Некоторую информацию о расположении мембранных белков дали новые методы, ставшие теперь уже "классическими", - методы замораживания-скалывания и замораживания-травления. В этих случаях препараты быстро замораживают, не подвергая их при этом каким-либо повреждающим воздействиям, как при получении тонких срезов. Процесс подготовки препарата включает следующие операции.

После замораживания образец, представляющий собой суспензию клеток или мембран, скалывают с помощью ножа при низкой температуре в глубоком вакууме. Возникающие при скалывании усилия приводят к образованию среза, проходящего через образец. Оказалось, что, когда плоскость среза проходит через мембрану, последняя раскалывается преимущественно по своей срединной области и расщепляется на две половинки. В результате на образовавшихся плоскостях скола обнажается внутренняя область мембраны.

При необходимости образец подвергают травлению - проводят обычную возгонку льда в вакууме. Это позволяет лучше визуализировать поверхностные структуры клеточных мембран.

После этого получают так называемую реплику с обнаженной поверхности. Именно эту реплику и изучают под электронным микроскопом. Для получения реплики сначала напыляют на образец платину под углом около 45°, чтобы выявить топологические характеристики препарата. Затем платиновой реплике придают механическую прочность, нанеся на нее слой углерода. После этого препарат оттаивают, реплика всплывает, и ее вылавливают с помощью специальной сеточки.

Наиболее характерные структуры, наблюдаемые при изучении мембран методом замораживания-скалывания, - это многочисленные внутримембранные частицы диаметром от 80 до 100 А, лежащие в плоскости мембранных сколов. Обычно они расположены хаотично, но иногда образуют группы. Многочисленные исследования показали, что эти частицы, возможно, являются мембранными белками. Любопытно, что при электронной микроскопии тонких срезов подобные структуры не обнаруживаются. Реплики, полученные от двух половинок расщепленной мембраны, не всегда бывают топологически комплементарными. Это означает, что некоторые частицы связаны только с одной из половин мембраны. Данные, полученные методом замораживания-скалывания, широко использовались Сингером и Николсоном при создании жидкостно-мозаичной модели мембран, поскольку они убедительно показывали, что глобулярные белки находятся не только на поверхности мембраны, но и внутри бислоя.

На рис.1.6 приведена электронная микрофотография препарата протеолипосом, реконструированных из яичного фосфатидилхолина и нефракционированного препарата белка полосы 3 из мембраны эритроцитов человека; препарат получен методом замораживания - скалывания.

Белок полосы 3 является основным белковым компонентом мембраны эритроцитов и, как известно, осуществляет перенос анионов. Если фосфолипидные везикулы не содержат этого белка, то полученные препараты замороженных сколов имеют гладкую поверхность.

При встраивании белка полосы 3 в фосфолипидные везикулы на сколах появляются внутримембранные частицы, практически неотличимые от частиц, наблюдаемых в мембранах эритроцитов. Более того, при рН 5,5 частицы, наблюдаемые в мембране эритроцитов, агрегируют, причем эта агрегация осуществляется в результате взаимодействия белка полосы 3 с двумя другими белками, спектрином и актином.

Последние являются компонентами цитоскелета, находящимися на внутренней поверхности эритроцитарной мембраны. Аналогичным образом ведет себя и реконструированная система, состоящая из белка полосы 3 и фосфатидилхолина, при этом агрегация частиц наблюдается в присутствии спектрина и актина при рН 5,5, но не при рН 7,6.

Эти данные еще более упрочили представление о мембранных белках как о глобулярных частицах, свободно перемещающихся в плоскости мембраны. Интересно, что статичные микрофотографии препаратов, полученных методом замораживания-скалывания, помогли исследователям в изучении динамических свойств мембран. Как мы увидим, в мембранах есть много белков, которые не могут свободно плавать в "липидном море".