Тонкослойная хроматография липидов
Для проведения хроматографии используют полученный экстракт суммарных липидов. Носителем является силикагель. В работе используют готовые пластинки марки «Silufol». Перед нанесением пробы край пластинки, предназначенный для погружения в растворитель (нижний край), подвергают окантовке, т.е. слой силикагеля шириной 3-4 мм полностью соскабливают скальпелем в виде ровной полоски. Затем приступают к разметке линии старта. Она должна отстоять от нижнего края слоя силикагеля на 1-1,5 cм. Эта линия намечается несколькими уколами иглы в слой силикагеля. Точки нанесения проб по стартовой линии должны отстоять от боковых краев пластины на 2-2,5 см. Расстояние между точками 2 см. Таким образом, на пластинку размером 9х12 cм экстракт наносится в 3 точки. В местах нанесения не должно быть повреждений целостности слоя от прикосновения микропипетки (капилляра). Нанесения производят микропипеткой на 0,1 мл либо стеклянным капилляром. Хлороформенный экстракт липидов наносят порциями по 0,02 мл при помощи микропипетки либо капилляра на выбранную точку на пластинке. Всего наносят 0,1-0,15 мл экстракта. После каждого нанесения дают испариться хлороформу. При нанесении экстракта диаметр пятен не должен превышать 3-5 мм. Пластинку после нанесения экстракта липидов помещают в стеклянную, плотно закрытую камеру, обложенную внутри фильтровальной бумагой, в которую предварительно налита подвижная фаза. Количество этой фазы должно обеспечить слой жидкости на дне камеры высотой 0,8-1,0 см. В качестве подвижной фазы употребляют смесь - петролейный эфир: бутиловый эфир уксусной кислоты: уксусная кислота (70:30:1 по объему). Пластинку устанавливают в камере под углом 45-60°С. Время разгонки 45-60 мин (зависит от температуры помещения). Фронт растворителя за это время должен подняться на 9-10 см. При вынимании пластинки из камеры отмечают иглой положение фронта растворителя (для последующего вычисления величины Rf). Пластинку сушат под тягой на воздухе, разрезают на 3 равные части. Каждую полоску обрабатывают следующими методами: Окраска родамином Ж. Одну часть высушенной хроматограммы помещают на 3-4 мин в раствор 0,002%-ого родамина Ж. Избыток красителя смывают водой и хрматограмму просматривают в ультрафиолете. Окраска парами йода. Вторую часть пластинки помещают на несколько минут в камеру, насыщенную парами йода. На хроматогpaмме появляются желтые или коричневые пятна липидов, содержащих ненасыщенные жирные кислоты. Окраска нингидрином. Третью часть пластинки помещают в раствор 0,25 % нингидрина в ацетоне. При нагревании в сушильном шкафу (t= 800С) либо над электроплиткой появляются фиолетово-розовые пятна липидов, содержащих аминогруппы.
|
