Лабораторные методы подтверждения факта инфицированности ВИЧ

Общепризнанным скрининговым методом диагностики ВИЧ-инфекции является иммуноферментный анализ определения антител к ВИЧ – ИФА. Обязательно следует учитывать, что в 95-98% случаях антитела к ВИЧ образуются в течение первых 6-12 недель, в 2-5% - только через 3-6 месяцев после заражения и лишь у 0.5-1 % людей - в более поздние сроки. Если прошло менее 12 недель, или 3-х месяцев, после вероятного инфицирования, то ИФА может быть ложноотрицательным. Этот период времени между моментом проникновения ВИЧ в организм человека и появлением антител к нему в сыворотке крови, которые выявляются ИФА, называют периодом «окна», или «сероконверсии» (от лат. serum - сыворотка).

При положительном результате ИФА пациенту рекомендуют обратиться к инфекционисту Центра СПИД или специализированных клиник для консультации и проведения повторного исследования крови. Дополнительно назначают специальный подтверждающий тест – иммунный блотинг, принцип которого заключается в выявлении антител к определенным белкам ВИЧ, или гликопротеидам (gp). На нитроцеллюлозу нанесен вируснный АГ (env,pol полимераза,gag - сердцевина) - инкубация с образцами- промывка -+АТ к IgGпациента. Меченные щелочной фосфатазой, икуб, отмвыка+хромоген - появление специф. окраш полос - наличие АТ. Результат: + - наличие 1/2 полос env+-pol+-gag, не опред. - pol +gag, отр - нет полос

При выявлении антител к одному из гликопротеидов - gp 41, 120, 160 – результат считают положительным. В случае обнаружения антител к другим белкам вируса ответ расценивают как сомнительный и рекомендуют повторить обследование через 3 и 6 месяцев. Отсутствие антител к белкам вируса в реакции иммунного блотинга означает, что первый ИФА был ложноположительным.

Следует правильно понимать, что позитивный результат ИФА на антитела к ВИЧ – это не диагноз. Только врач может поставить диагноз ВИЧ-инфекции после повторного ИФА, врачебного осмотра и проведения дополнительных лабораторных тестов. И только врач может исключить этот диагноз при отрицательных повторных результатах ИФА.

Если человек попал в ситуацию, потенциально опасную по передаче ВИЧ, ему рекомендуется как можно раньше обратиться за медицинской помощью и начать проведение постконтактной профилактики АРВ-препаратами, не дожидаясь, пока истекут необходимые для появления антител и проведения ИФА 3 месяца.

 

Тесты 1 уровня- серологич. скрининговое обслед-е ИФА;

Тесты 2 уровня - арбитражные исследования первично серопозитивных проб ИФА - макс возможные наборы тест-систем;

Тесты 3 уровня - скрининговые арбитражные и подтверждающие исследования ИФА, иммуноблотинг.

 

2. Проточная цитофлюориметрия

3. СД4 - 200 - критический уровень

 

В нашей стране широко используется также метод ПЦР (полимеразной цепной реакции) для определения наличия РНК вируса в крови пациента. Он необходим для определения «вирусной нагрузки», то есть количества копий РНК ВИЧ в 1 мл крови, контроля эффективности АРВ-терапии и диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-позитивных матерей.

(ВИЧ – медленно прогрессирующее заболевание с многолетней репликацией вируса в лф, мф и клетках нервной ткани, вызывающей нарушение иммунной и нервно-психической регуляции организма => гибель больного от поражений вторичного порядка, обусловленных нарастающим иммунодефицитом. ВИЧ относится к РНК-содержащим ретровирусам. Способен синтезировать в клетках хозяина ДНК своего генома. Вирусная ДНК включается в геном лиц, где ее экспрессия создает условия развития хронической инфекции. Вирус иммунодефицита человека генетически и антигенно неоднороден: выделены ВИЧ-1 и ВИЧ-2. При заражении ВИЧ-1 продолжительность жизни составляет 10-12 лет, а ВИЧ-2 – свыше 20-25 лет. Впервые был выделен в 1983 от больного лимфоаденопатиейв институте Пастера и в 1984 в США.

Чувствителен к действию детергентов. ПАВ, спиртов, хлорсодерж., перекись (1-3% хлорамин, 3% хлорной извести - через 15 мин). Полная инактивация при56С 30мин. Устойчив к УФ. Сохраняется на высушенных субстратах 7 сут.

Патогенез - цитопатическое действие на ИКК (разрушение, нарушение функций, спонтанная поликлональная активация В-л, гипергаммаглобулинемия). АГ вируса выступают в роли суперантигенов - гиперактивация специфичных и неспецифичных клонов - апоптоз - дефицит. Время от момента заражения до появления антител -3нед -3 мес. до 6 мес

Пути заражения ВИЧ инфекцией: -парантеральный -внутриутробный-вертикальный - половой

Клиническая картина:

1стадия: Латентный период. Период вирусоносительства без клинической манифестации. ПЦР

2 стадия: Первичной манифестации. От 2 нед до неск месяцев. острая инфекция(похожа на грипп,высокая тем-ра, инфекц.мононуклеоз) от 1 недели до месяца, ИФА ВИЧ- отрицателен.

3-стадия: ассимптомной инфекции (д-з.ставится на основании эпид.анализа и лаб-ых исследований)Отсутствуют клинические признаки, длится от 1 года до 10 лет.Продолжительность зависит от образа жизни, материального достатка и др)

4-стадия:персистирующая генерализованная лимфоаденопатия (увеличение лимф. узлов)

5-стадия: пре СПИД - от 2до 10 лет.Переход от ВИЧ-инфекции к стадии вторичных заболеваний + оппортунистические инфекции (кандидоз полости рта, туберкулёз лёгких,опоясывающий лишай,локализ.форма саркомы Капоши)Снижение массы тела на 10%, немотивированная лихорадка, диарея,общая слабость. и др.)

6-стадия: СПИД

Риск передачи ВИЧ в мед.уч. При парантеральном пути передачи (от пациента к персоналу и наоборот). При в/в; в\м; и др. инъекциях. При переливании крови и кровезаменителей, стоматолог, хирург, гинекологическом кабинете.

КЛ диагностика ВИЧ-инфекции имеет 3 направления: 1. Установление факта инфицированности ВИЧ, диагноза ВИЧ инфекции; 2. Определение стадии клинического течения б-ни и выявление вторичных заб-ий; 3. Прогноз прогрессии клин течения заб-ия и лаб контроль проводимого лечения.)

 

95. Микробиологические методы диагностики туберкулеза и определения лекарственной резистентности возбудителя.

 

Включает микроскопию препаратов, окрашенных по Цилю - Нильсену для выявления ми­кобактерий туберкулеза (кислотоустойчивых бактерий, КУБ),

Сбор мокроты для анализа на КУБ. На исследование на­правляются три пробы мокроты от каждого пациента. Первую пробу мокроты пациент собирает через 1-2 ч после сна под на­блюдением медицинского работника. Вторая проба мокроты со­бирается больным в тот же день через несколько часов после взятия первой пробы. Третья проба - утром следующего дня.

Пациенту следует откашливать мокроту из более глубоких отделов легких. Во время забора мокроты медработник должен стоять за спиной больного. Для исследования необходимо полу­чить достаточное количество мокроты (3-5 мл), содержащей плотные гнойные частицы, а не слюну.

Техника приготовления и окраски препаратов Бактерии чаще обнаруживаются в плотных гнойных частицах мокроты. Результат исследования в большей степени зависит от правильного выбора этих частиц. Гнойные частицы выбирают из 4-6 разных мест, распределяют по предметному стеклу тонким слоем. Мазок можно приготовить и другим способом. Стекло с отобранной мокротой покрывают другим предметным стеклом и, придавливая друг к другу, тщательно растирают, раздвигая стек­ла в противоположном направлении.

Подготовленные мазки про­сушивают на воздухе в течение 15-30 мин. Подогревать препа­рат для высушивания не рекомендуется, так как при этом легко происходит разрушение микробных клеток. Высушенный мазок фиксируют трехкратным проведением его в течение 3-5 с через среднюю и наиболее яркую часть пламени спиртовки. Нужно из­бегать следующих ошибок: 1) изготовлений слишком толстых препаратов (трудно искать бактерии), 2) фиксирования плохо вы­сушенных мазков (получается плохая окраска), 3) недостаточной фиксации, ведущей к сползанию препарата, 4) длительной фик­сации над пламенем, вызывающей обугливание мокроты, что сильно отражается на качестве окраски.

Окраска по Цилю - Нильсену Предметные стекла помещают на мостик с промежутками между краями. Мазки накрывают фильтровальной бумагой. На всю по­верхность фильтровальной бумаги, покрывающей стекло, нано­сят карболовый фуксин Циля (1 г основного фуксина растворя ­ют в 10 мл этилового спирта, раствор выливают в 100 мл 50 г/л раствора карболовой кислоты). Стекло с мазком медленно нагре­вают над пламенем спиртовки до появления пара. Не допускает­ся кипение или высушивание окрашивающего раствора на пред­метном стекле. Если раствора недостаточно, его можно добавить еще и нагреть второй раз. Мазок с прогретым раствором остав­ляют на 5 мин, после чего фильтровальную бумагу удаляют пин­цетом и помещают в бачок для сбора отходов. Каждое предмет­ное стекло аккуратно ополаскивают отдельно под слабой струей воды из водопроводного крана до полного удаления окраши­вающего раствора. Мазок держат ребром к струе воды. Не раз­решается смывать и обесцвечивать одновременно несколько маз­ков во избежание перекрестного заражения. Все стекла помеша­ют на мостик и обрабатывают, каждый из них индивидуально, 250 г/л раствором серной кислоты до полного отхождения крас­ки. Смывают каждое предметное стекло как описано выше. За­тем каждый мазок обрабатывают 96% этиловым спиртом в течение 5 мин и промывают водой. Обесцвеченные, промытые стекла с мазками докрашивают (3 г/л водным раствором метиленового синего в течение 60 с), промывают, как описано выше, оставля­ют сушить на воздухе.