Учет и интерпретация результатов

Реакцию учитывают визуально и инструментально.

 

Визуальный учет

При оценке результатов сравнивают интенсивность окраски в лунках исследуемого материала с интенсивностью окраски в лунках отрицательного и положительного контролей.

Минимальная интенсивность окраски должна быть в лунках A1 и A2 с «отрицательным контролем» и может вариировать от практически бесцветной до желтовато-золотистого цвета субстратной смеси.

Окраска в лунках разведений дифтерийного анатоксина (B1-H1) изменяется от красновато-коричневого в первых лунках до бесцветного или желтовато-золотистого - в последних.

Положительными считаются пробы, давшие окраску отчетливо отличную от окраски лунок с отрицательным контролем.

Сравнивая интенсивность окраски лунок исследуемых проб с интенсивностью окраски лунок последовательного разведения дифтерийного анатоксина (в каждой лунке соответствующее содержание анатоксина в Lf/мл, см. схему), можно судить об относительном количестве токсина в тестируемой пробе.

 

Инструментальный учет

При учете реакции с использованием фотометра (длина волны 450 нм) предварительно строится калибровочная кривая, где на оси ординат откладывают значения оптической плотности (ОП) в лунках «положительного контроля» - анатоксина (B1-H1), а по оси абсцисс - соответствующие значения количества дифтерийного анатоксина в этих лунках (см. схему).

Если «положительный контроль» ставится на 2-х или более планшетах, то на оси ординат откладывают среднее значение ОП для каждой лунки, полученное путем деления суммы значений ОП лунки каждого планшета на количество показателей. Например, ОП лунки B1, содержащей 0,0375 Lf/мл или 1:8000 анатоксина, на первом планшете = 0,87, на втором = 0,862 и на третьм = 0,855; на оси ординат среднее значение ОП будет 0,861 [(0,87 +0,862 + 0,855):3 = 0,861], и так просчитывают для каждой лунки разведенного анатоксина среднее значение ОП.

Каждая точка графика (калибровочной кривой) откладывается по значению ОП, соответствующей своей лунке: B1, C1, D1, E1, F1, G1, H1, и т.о. вычерчивается калибровочная кривая.

Затем высчитывают средние значения ОП из 2-х лунок каждой исследуемой пробы и по калибровочной кривой определяют какой лунке соответствует значение ОП, и, следовательно, узнают количество анатоксина в лунке (в Lf/мл). Это значение (количество анатоксина в соответствующей лунке в Lf/мл) умножают на величину разведения исследуемой пробы, получая таким образом значение количества токсина в 1 мл пробы. Например, ОП пробы «X» = 0,51 и 0,49, среднее значение ОП=0,5; по калибровочной кривой этому значению ОП соответствует содержание анатоксина 0,018 Lf/мл в лунке C1 (см. рис. 3).

Учитывая, что исследуемая проба была разведена в 4 раза, необходимо показатель 0,018 Lf/мл увеличить в 4 раза (0,018 х 4 = 0,072), таким образом, в исследуемом материале (в пробе «X») содержится 0,072 Lf/мл токсина.

Калибровочную кривую строят в каждом опыте.

 

Типичный калибровочный график, полученный с использованием тест-системы «Дифтерия-Монозим», длина волны 450 нм

(фотометр марки Titertec^® Multiscan)

Рисунок 3

Единицы

ОП

 

0,8

0,7

 

0,6

 

0,5

 

0,4

 

0,3

 

0,2

 

0,1

B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1 лунки

В Lf/мл содержа-

ние анатоксина:

разведение (титры) 0,037 0,018 0,009 0,004 0,002 0,001 0,0005

в тысячах 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512

 

Положительными считаются пробы, ОП которых превосходит ОП «отрицательного контроля» не менее, чем на 0,1 единицы ОП. Например, ОП «отрицательного контроля» = 0,029 и 0,031; средняя величина ОП = 0,03, тогда положительными считаются все пробы, ОП которых выше 0,13 (0,03+0,1=0,13).

При получении значения ОП в исследуемой пробе выше значения ОП анатоксина лунки B1, в случае определения степени токсинообразования штамма, исследование следует повторить, при этом разведение пробы должно быть увеличено.

При существенном различии ОП в лунках-дубликатах одной пробы результат тестирования считать сомнительным и исследование пробы повторить.

Тест-система удовлетворяет требованиям специфичности, если окраска в лунках с «отрицательным контролем» варьирует от практически бесцветной до желтовато-золотистой, а в лунках с «положительным контролем» - от красновато-коричневой до бесцветной или желтовато-золотистой.

Тест-система удовлетворяет требованиям по чувствительности если положительная реакция (визуально или инструментально) выявляется в лунке «положительного контроля», содержащей анатоксин в разведении не ниже 1:128000 (лунка G1 с концентрацией анатоксина 0,002 Lf/мл).

Об удовлетворительном качестве жидкой питательной среды, используемой для культивирования коринебактерий дифтерии или патологического материала, свидетельствует положительная реакция верхнего слоя среды культивирования контрольного токсигенного штамма коринебактерий дифтерии в разведении не ниже 1:32.

 

Реакция непрямой агглютинации

 

Для проведения РНГА необходимы:

n коммерческий набор «Диагностикум эритроцитарный дифтерийный антительный жидкий для определения токсина в РНГА» (изготовитель - НИИЭМ им. Л.Пастера, 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, тел. 233-20-92);

n капельницы, петли из набора Такачи объемом 0,025 мл (возможна постановка реакции петлями объемом 0,05 мл, что предполагает увеличение расхода диагностикума и других компонентов реакции в 2 раза), или автоматические пипетки, установленные на объем 25 мкл (50 мкл);

n мерная посуда;

n дистиллированная вода;

n 0,85% раствор хлорида натрия с 0,5% -ным содержанием нейтрального формалина, pH 7,2 (раствор 1);

n планшеты «U»-образные (сферическое дно) из набора Такачи или отечественного производства для иммунологических реакций.

Набор диагностикума содержит:

1) диагностикум эритроцитарный жидкий 3%-ный;

2) положительный контроль - дифтерийный анатоксин, жидкий, 10 Lf/мл;

3) нормальная кроличья сыворотка (НКС), сухая, 10%-ная.