Подготовительные работы при исследовании материала в РНГА

Накануне тестирования исследуемого материала.

1. Приготовление раствора 1.

К 79 мл 0,85% раствор хлорида натрия с pH 7,2 добавляют 1 мл нейтрального 40% -ного раствора формалина, размешивают. Хранят при температуре 4⁰ С без ограничения срока.

1.1. Приготовление 0,85% раствор хлорида натрия с pH 7,2.

Навеску хлорида натрия 8,5 г растворяют в 1000 мл свежеперегнанной дистиллированной воды, тщательно перемешивают. Доводят pH до 7,2 с помощью гидроксида натрия 4%-ной концентрации.

1.2. Приготовление 4%-ного раствора гидроксида натрия (NaOH).

4 г гидроксида натрия растворяют в 96 мл дистиллированной воды. Хранят в плотно закрытой склянке или полиэтиленовом флаконе при температуре 4⁰ С в течение 1 месяца.

1.3. Приготовление нейтрального формалина.

Коммерческий 40%-ный раствор формалина нейтрализуют добавлением углекислого кальция (CaCO₃) или углекислого магния (MgCO₃) в соотношении 3:1. Оставляют в темном месте при комнатной температуре на 2-3 дня, периодически взбалтывая. Затем дают раствору отстояться. Перед употреблением с помощью индикатора бромтимоловый синий проводят контроль pH, значение которого должно быть 7,0. Надосадочную жидкость по мере надобности разводят в 80 раз для получения 0.5%-ной концентрации.

2. Подготовка исследуемого материала, положительного и отрицательного контролей.

Накануне постановки РНГА исследуемый материал, контрольные токсигенные и нетоксигенные штаммы коринебактерий дифтерии засевают в жидкую питательную среду (см. раздел «Питательные среды») и инкубирую при 37⁰ С в течение 18 часов. Параллельно инкубируют пробу жидкой питательной среды без материала.

В день постановки реакции готовят рабочие разведения всех компонентов реакции.

1. Приготовление рабочего разведения дифтерийного анатоксина 1:100.

Раствор готовят методом последовательных разведений. Разведение анатоксина 1:10 - из флакона, содержащего 10 Lf/мл, переносят 0,2 мл в пробирку, содержащую 1,8 мл раствора 1, тщательно перемешивают; разведение анатоксина 1:100 - 0,1 мл анатоксина в разведении 1:10 вносят в 0,9 мл раствора 1, тщательно перемешивают (содержит 0,1 Lf/мл). Раствор хранению не подлежит!

2. Приготовление нормальной кроличьей сыворотки 1%-ной концентрации - раствора 2 (используется только для разведения диагностикума).

Во флакон «Нормальная кроличья сыворотка, 10%-ная, сухая» вносят 2 мл раствора 1, тщательно перемешивают (раствор 10%-ной концентрации можно хранить при 4⁰ С до 1 мес), затем переносят в мерную емкость и доводят объем раствором 1 до 20 мл. Раствор НКС 1%-ной концентрации имеет вид слегка опалесцирующей жидкости, который можно хранить при комнатной температуре не более 10 часов.

3. Приготовление раствора диагностикума в рабочем разведении (0,5%-ной концентрации).

Диагностикум эритроцитарный 3%-ной концентрации при хранении образует 2 слоя: прозрачная бесцветная надосадочная жидкость и осадок коричневого цвета, разбивающийся при встряхивании. Разгерметизированный 3%-ный раствор диагностикума можно хранить при 4⁰ С в течение месяца. Для приготовления 0,5% раствора диагностикума к содержимому флакона (после встряхивания) добавляют 4 мл раствора 2, тщательно перемешивают, переносят в мерную емкость, добавляют еще 6 мл раствора 2, получая т.о. рабочее разведение диагностикума. Раствор 0,5%-ной концентрации при комнатной температуре не более 10 часов.

4. Подготовка планшетов и петель.

Лунки планшетов протирают тампоном, смоченным раствором 1; петли прожигают. В дальнейшем обработку петель проводят в соответствии с «Наставлением к аппарату Такачи».