Среды для первичного посева исследуемого материала

Среда Клауберга II

К 100 мл стерильной питательной агаровой основы (pH - 7,6), расплавленной и охлажденной до 50⁰, добавляют 3 мл 2% -ного раствора теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл «лаковой» крови. Принимая во внимание, что питательная среда разводится глицериновой смесью и «лаковой» кровью в 1,6 раза, при приготовлении данной среды следует увеличить навеску сухого питательного агара в 1,6 раза.

Пример расчета. На этикетке флакона с сухим коммерческим питательным агаром указана навеска, необходимая для приготовления 1 л среды, например, 30 г. Для приготовления 1 л питательной основы для среды Клауберга II следует взять навеску 48 г (т.е. 30 г х 1,6 = 48 г).

Для приготовления глицериновой смеси к 40 мл дефибринированной крови или кровяной смеси добавляют 20 мл химически чистого стерильного глицерина (глицерин стерилизуется при температуре 110⁰ С в течение 30 мин).

Для приготовления «лаковой» крови к 34 мл стерильной дистиллированной воды добавить 16 мл дефибринированной крови.

 

Кровяно-теллуритовый агар (КТА)

К 100 мл стерильной питательной агаровой основы (pH - 7,6), расплавленной и охлажденной до 50⁰, добавляют 2 мл 2% -ного раствора теллурита калия и 7 мл дефибринированной или 10 мл гемолизированной крови. Вместо крови можно использовать кровяную теллуритовую смесь (10 мл на 100 мл среды), однако при этом на 100 мл КТА добавляют не 2, а 1 мл 2% -ного раствора теллурита калия. Принимая во внимание, что питательная среда разводится кровью примерно в 1,1 раза, при приготовлении данной среды следует увеличить навеску сухого питательного агара в 1,1 раза.

Пример расчета. На этикетке флакона с сухим коммерческим питательным агаром указана навеска, необходимая для приготовления 1 л среды, например, 30 г. Для приготовления 1 л питательной основы для КТА следует взять навеску 33 г (т.е. 30 г х 1,1 = 33 г).

 

Среда Клауберга II и кровяно-теллуритовый агар на аминопептиде

Состав агаровой основы на аминопептиде для среды Клауберга II (расчет на 1 л):

1. Аминопептид....................................................................0,35 л

2. Дистиллированная вода.................................................0,65 л

3. Сухой экстракт кормовых дрожжей (ЭКД)......................... 5,0 г

4. Хлорид натрия....................................................................4,0 г

5. Агар-агар...........................................................................24,0 г

6. L-цистеина гидрохлорид...................................................0,01 г

7. Активированный уголь......................................................3,0 г

Состав агаровой основы на аминопептиде для кровяно-теллуритового агара (расчет на 1 л):

1. Аминопептид....................................................................0,25 л

2. Дистиллированная вода....................................................0,75 л

3. Сухой экстракт кормовых дрожжей (ЭКД)......................... 5,0 г

4. Хлорид натрия....................................................................4,0 г

5. Агар-агар...........................................................................18,0 г

6. L-цистеина гидрохлорид...................................................0,01 г

7. Активированный уголь.......................................................3,0 г

Аминопептид разводят дистиллированной водой, добавляют хлорид натрия, агар-агар и кипятят до расплавления агара, добавляют ЭКД, размешивают до полного его растворения, устанавливают pH-7,8 с помощью 20% раствора NaOH. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят до первоначального объема дистиллированной водой, добавляют L-цистеина гидрохлорид (можно также использовать L-цистеин, растворенный в 0,1 N растворе HCl) и активированный уголь.

Приготовленные питательные агаровые основы разливают в стерильные флаконы и стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Сохраняются питательные основы при 4⁰ в течение 2 месяцев.

Среда Клауберга II и кровяно-теллуритовый агар готовятся на соответствующих питательных агаровых основах по вышеуказанным прописям.

 

Методика приготовления кровяных и кровяно-теллуритовых смесей

 

Для приготовления питательны сред лучше всего использовать дефибринированную кровь животных - крупного рогатого скота, лошадей,свиней, овец, кроликов. Кровь собирают в стерильные сосуды с бусами, с помощью специально смонтированной системы, тщательно соблюдая правила асептики.

Можно использовать кровь человека с истекшим сроком годности (цитратную и с консервантами), приготовив из нее специальные кровяные смеси. При использовании такой крови, следует удалить жидкую часть отстоявшейся крови, содержащую цитрат натрия, консерванты. К отстоявшейся в сосуде эритроцитарной массе добавить стерильный физиологический раствор или сыворотку крупного рогатого скота до первоначального объема и теллурит калия.

Хорошим сырьем для получения кровяной смеси служит эритроцитарная масса, которая остается после производства гамма-глобулина. К эритроцитарной массе добавляют стерильный физиологический раствор из расчета 1/5 объема эритроцитарной массы и теллурит калия.

Можно также использовать кровяные сгустки, остающиеся от производства гамма-глобулина, после серологических реакций (при отрицательном результате реакций), сгустки плацентарной или абортной крови. Сгустки собирают в стеклянные бутыли с бусами, затем сгустки разбивают. Если сгустки не удается разбит бусами, их замораживают и оттаивают, после чего сгустки легко разрушаются. Эту процедуру можно повторить 2-3 раза. Затем добавляют стерильный физиологический раствор из расчета 1/5 объема сгустков и теллурит калия.

Теллурит калия добавляют к крови или кровяной смеси в качестве консерванта. К каждой порции крови или кровяной смеси в 10 мл, добавляемой к 100 мл агара, приливают 1 мл 2%-ного раствора теллурита калия. Такую кровяно-теллуритовую смесь можно сохранять при 4⁰ до 2-х месяцев.

Пример расчета. К 200 мл эритроцитарной массы, после удаления 50 мл жидкой части отстоявшейся крови, добавляют такое же количество – 50 мл физиологического раствора или сыворотки крупного рогатого скота (без консерванта). Таким образом, получается 250 мл кровяной смеси, что достаточно для приготовления 2,5 л КТА. Для консервирования 250 мл кровяной смеси необходимо добавить 25 мл 2%-ного раствора теллурита калия.

В дальнейшем, при приготовлении кровяно-теллуритовой среды, на каждые 100 мл растопленного и охлажденного до 50⁰ питательного агара добавляют 10 мл консервированной теллуритом калия кровяной теллуритовой смеси и 1 мл 2%-ного теллурита калия.

 

Приготовление раствора телурита калия (K₂TeO₃)

 

Для приготовления теллуритовых сред используют готовый коммерческий 2%-ный раствор теллурита калия.

При отсутствии готового раствора теллурита калия его готовят следующим образом. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 2 г теллурита калия. Для стерилизации раствор прогревают в кипящей водяной бане 30 мин и сохраняют при температуре 4⁰. Кристаллический теллурит калия хранят герметически закрытым в банке из темного стекла.