ГЛАВА 3. ЭТИОЛОГИЯ И ПАТОГЕНЕЗ

Причины развития ММ у человека и учащения этого заболевания в последние десятилетия ос­таются неясными. Обсуждаются ряд факторов.

Генетическая предрасположенность, связанная скорее всего с дефектами Т-клеточной супрессорной функции, влияние хронической антигенной стимуляции, радиационные и химические воздей­ствия и вирусные повреждения генома.

Плазмоцитома возникает спонтанно и легко индуцируется у мышей. Опухоль перевивается инбредным животным, хорошо растет в культуре, из которой ее легко перевить животному вновь. Основные исследования по выяснению этиологии и патогенеза заболевания в настоящее время выполняются на чистых линиях мышей. Генети­ческая предрасположенность к индукции и спон­танному возникновению плазмоцитомы доказыва­ется разной чувствительностью различных инбредных линий мышей и их гибридов.

Расовые различия частоты миеломы у людей, отдельные описания семейных случаев болезни принято расценивать как доказательства извест­ной генетической предрасположенности к заболе­ванию.

Серьезных аргументов в пользу индуцирующе­го влияния лучевого воздействия на развитие ММ нет. Этиологическая роль вирусов не доказана.

Методом радиоактивной метки в культурах мышиных и человеческих плазмацитом было по­казано, что опухоль состоит из пролиферативного и созревающего пула. В пролиферативной час­ти была выделена стволовая самоподдерживаю­щаяся популяция - стволовые клетки опухоли, спо­собные образовывать колонии при транспланта­ции облученным реципиентам и в культуре. Пролиферирующий пул опухоли состоит в основном из клеток лимфоцитарной структуры.

Плазмоклеточный пул ММ представляет собой конечный этап дифференцировки клеток моноклона, ранние стадии ко­торого находятся на уровне пре-В- или про-В-лимфоцитов, если не самой стволовой клетки крове­творения. Все сказанное убедительно свидетель­ствует, что при ММ объектом опухолевой транс­формации является клетка-предшественница В-лимфоцитов и что, будучи опухолевой, она способ­на дифференцироваться до конечного этапа - плазмоцита, секретирующего моноклональный Ig.

Современные представления о развитии В-лимфоцитов и этапах их дифференцировки доказывает, что мишенью онкологичес­кой трансформации при ММ является поздняя ста­дия В-лимфоцита - клетки, проделавшей этапы антигензависимой дифференцировки, переключе­ния изотипов Н-цепей Ig и гипермутаций генов вариабельного региона Ig. Основной аргумент этого допущения таков: плазматические клетки при ММ секретируют Ig G, D, А, Е - продукты, характерные для вторичного иммунного ответа, следовательно, прежде чем превратиться в опухолевые, они нормально проконтактировали с антигеном и переключили изо­тип Н-цепи и несколько изменили вариабельный регион Ig в результате гипермутации.

Возникший в результате вопрос об уровне трансформации В-лимфоцита в опухолевый пред­шественник миеломы сегодня практического зна­чения не имеет, однако радикальное излечение ММ без элиминации стволового пула опухоли или его надежного сдерживания невозможно. К сожа­лению, все приемы интенсивной терапии ММ, включая высокодозные миелоаблативные про­граммы и тотальное облучение с последующей алло- или аутотрансплантация костного мозга, не могут привести к полной ликвидации стволовых миеломных клеток, даже так называемые "молекулярные" ремиссии, когда методом ПЦР не обнаруживаются клетки опухолевого моноклона, все же расцениваются как ремиссия, а не излечение, так как неизбежен рецидив.

Частота мутаций клеток плазмоцитомы на 3-5 порядков выше частоты мутаций микробов и нор­мальных клеток животных.

Изучение типов и частоты мутаций позволило выявить определенные закономерности их появ­ления. С наибольшей частотой (1:1000) возника­ют мутанты, секретирующие легкие (L) цепи Ig без Н-цепей (миелома Бенс-Джонса). С несколько меньшей ча­стотой продуценты L-цепей превращаются в несекретирущие клетки и далее - в непродуцирующие элементы опухоли. Среди клеток-мутантов возможно появление продуцентов с измененными генами вариабельного региона Ig; частота таких мутаций составляет 0,1-1%. Применение цитостатических средств увели­чивает число мутантов. Так, мелфалан не только повышает частоту появления продуцентов L-це­пей, но и изменяет структуру Н-цепей (аминокис­лотные делеции) у 30-40% мутантных клонов.

Строение молекулы иммуноглобулина

 

Для того чтобы понять особенно­сти клинического течения ММ, следует, хотя бы кратко, рассмотреть биологию нор­мальных В-лимфоцитов и плазмати­ческих клеток. Развитие и созрева­ние В-лимфоцитов может быть раз­делено на две основные фазы - ан­тигеннезависимую и антигензависимую. Процесс дифференцировки В-клеток-предшественников в зрелые клетки характеризуется двумя важ­ными событиями; сериями реаранжировок (перестроек) сегментов ге­нов Ig, а также приобретением и потерей поверхно­стных маркеров в зависимости от последовательности этапов диффе­ренцировки. Первая фаза лимфопоэза проис­ходит у взрослых в костном мозге и является антигеннезависимой. Она включает образование В-линейных клеток из стволовых клеток и их последовательную дифференцировку (видоизменение) в В-клетки-девственницы (virgin-клетки). На данном этапе видо­изменения В-клеток сопровождаются перестрой­ками сегментов генов Ig в фор­му экзонов, ответственных за синтез тяжелых и легких цепей. Гены, кодирующие синтез тяжелых и легких цепей Ig, локализованы в хромосоме 2 (для κ), 22 (для ג) и 14 (для тя­желых цепей). В-клетки-девственницы экспрессируют на своей поверхности следующие маркеры: поверхностные IgM и IgD, а также CD19 и CD20. На этом этапе В-клетки-девственницы покидают костный мозг и мигрируют в перифе­рические лимфоидные органы.

 

Схема лимфопоэза

Вторая фаза лимфопоэза осуществляется в периферических лимфоидных органах. После вза­имодействия с антигеном происходят активация и клональная пролиферация В-клеток-девственниц. Часть клона В-клеток-девственниц дифференци­руется в короткоживущие плазматические клетки, которые всегда локализованы в экстрафоллику­лярной области лимфатических узлов или крас­ной пульпе селезенки и синтезируют в основном IgM. Другая часть В-клеток-девственниц мигрирует в первичные фолликулы, а затем в терминальный центр лимфатического узла, где впоследствии дифференцируется в центробласты. Эта фаза дифференцировки В-лимфоцитов характеризуется двумя чрезвычайно важными процессами в генах Ig - соматическими гипермутациями и пере­ключением изотипа синтезируемых антител. Со­матические мутации происходят в гипервариа­бельных участках генов Ig. Ме­ханизм соматических мутаций связан с переклю­чением изотипа синтезируемых антител.

В зародышевом центре лимфатического узла в присутствии активированных Т-лимфоцитов В-клетки-девственницы претерпевают значитель­ные изменения при взаимодействии с антигена­ми на поверхности фолликулярных дендритичес­ких клеток.

Наиболее важным моментом этого процесса является изотипическое переключение, при кото­ром В-клетки переключаются с синтеза ранее продуцируемого IgM на синтез IgG, IgA или IgE. Переключение происходит преимущественно с синтеза IgM на синтез IgG. Этот класс Ig и является основным в нормальной сыворотке крови человека. Синтез В-клетками IgG свидетельствует о том, что клетка подверг­лась антигенной стимуляции.

В зародышевом центре центробласты диффе­ренцируются в центроциты. В процессе дальней­шей дифференцировки центроциты с поверхнос­тными антителами, недостаточно соответствую­щими антигену (низкоаффинные антитела), под­вергаются апоптозу. Центроциты, экспрессирующие высокоаффинные антитела, проходят следу­ющий этап дифференцировки и превращаются в клетки памяти и плазмобласты. Плазмобласты возвращаются в костный мозг и при взаимо­действии с элементами костномозгового микро­окружения созревают окончательно - дифферен­цируются в зрелые плазматические клетки. Зре­лые плазматические клетки продуцируют огром­ное количество Ig, которые и обеспечивают все разнообразие антител и гумо­ральную защиту организма.

Дифференцировка В-клеточной линии лимфо­цитов в плазматические клетки связана с приоб­ретением или потерей поверхностных маркеров. Точный фенотип нормальных плазматических клеток установлен недостаточно точно из-за ма­лого количества их в образцах нормального костного мозга. Фенотип плазматических клеток имеет две особенности. Первая особенность зак­лючается в том, что в процессе трансформации В-лимфоцитов в плазматические клетки теряется большинство В-специфических маркеров. Второй особенностью является приобретение в процессе трансформации большого количества адгезивных структур.

Наиболее важными маркерами, по которым опухолевые миеломные клетки, вероятно, можно отличить от нормальных плазматических клеток костного мозга, являются экспрессия CD138 в комбинации с высокой экспрессией CD38 и отсутствием экспрессии CD19.

Наличие высокой экспрессии CD138 на плаз­матических клетках костного мозга является чув­ствительным и специфичным маркером при ММ. CD138 также экспрессируется плазматическими клетками, циркулирующими в крови, и другими экстрамедуллярными плазма­тическими клетками, но уровень экспрессии зна­чительно ниже, чем в клетках костного мозга.

CD38 - наиболее характерный поверхност­ный маркер как миеломных, так и нормальных плазматических клеток. CD38 относится к группе энзимов, участвующих во внутриклеточ­ном обмене кальция.

Важным маркером, позволяющим отличить опухолевые плазматические клетки от нормаль­ных, является экспрессия CD19. Нормальные плазматические клетки обычно экспрессируют CD19, в то время как для миеломных клеток экспрессия CD19 не характерна.

Миеломные клетки всегда несут на своей по­верхности СD40 - пан-В-клеточный антиген, кото­рый экспрессируется и нормальными плазмати­ческими клетками. Молекулы CD40 относятся к подсемейству рецепторов туморнекротического фактора. В настоящее время сведения о роли этого маркера на миеломных клетках противоречивы. С одной стороны, имеются дан­ные об участии CD40 в клеточной пролиферации, связанной с секрецией ИЛ-6, с другой - опубликованы сообщения о том, что CD40 име­ет отношение к прекращению опухолевого роста за счет индукции апоптоза.

В большинстве случаев миеломные клетки имеют высокую экспрессию CD56, в то время как нормальным плазматическим клеткам экспрессия этого маркера не свойственна. Пред­полагают, что CD56 включается в процессы адгезии и имеет отношение к остеолизу. У больных с ММ при наличии крупных остеолитических очагов выявляются миеломные клетки, несущие CD56, в то время как в отсутствие крупных остеолитических пора­жений не отмечено экспресии миеломными клет­ками этого антигена. Потеря CD56 ассоции­руется с более агрессивным течением и тенденци­ей к диссеминации плазматических клеток в пе­риферической крови. CD56 полностью отсутству­ет на миеломных клетках больных плазмоклеточным лейкозом как в костном мозге, так и в периферической крови.

CD28 - универсальный маркер для выявле­ния прогрессирования при парапротеинемических гемобластозах. Экспрессия его нарастает при прогрессировании заболевания, а также при рецидивах; наиболее высокий уровень CD28 от­мечается при экстрамедуллярных рецидивах. Эк­спрессия этого маркера может иметь прогности­ческое значение.

Таким образом, при ММ в костном мозге можно выделить два варианта миеломных клеток, различающихся по уровню экспрессии CD56: первый - с иммунофенотипом CD138+++, CD38+++, CD 19-, слабой экспресси­ей CD40+ и высокой экспрессией CD56+++, вто­рой - с тем же фенотипом по CD138, CD38, CD19 и CD40, но слабой экспрессией CD56+. В процессе прогрессирования болезни экспрессия CD28 нарастает. Экстрамедуллярные миеломные клетки имеют несколько иной фенотип: CD 138+++, CD38+++, CD19-, CD28+ со слабой эк­спрессией CD56.

Важную роль в процессе созревания и дифференцировки опухолевого клона при ММ играют цитокины. В 1988 г. М.Каwano и соавт. предположили, что интерлейкин-6 (ИЛ-6) стимули­рует пролиферацию миеломных клеток. В дальнейшем это предположение было подтвер­ждено и установлено, что ИЛ-6 индуцирует про­лиферацию и дифференцировку не только мие­ломных клеток, но и В-клеток-предшественников патологического клона. Кроме того, ИЛ-6 активирует ряд клеток внекостномозгового происхождения. ИЛ-6 стимулирует синтез белков острой фазы гепатоцитами. По данным исследо­ваний, проведенных в начале 90-х годов, ИЛ-6 стимулирует синтез С-реактивного белка (СРБ) в куль­туре гепатоцитов. В последующие годы для оценки активности ИЛ-6 стали определять уровень СРБ. ИЛ-6 секретируется главным обра­зом стромальными клетками костного мозга и отчасти плазматическими клетками. Высо­кий уровень ИЛ-6 в сыворотке и большое число рецепторов к ИЛ-6 на поверхности плазматичес­ких клеток выявляются при агрессивном течении ММ и прогрессировании болезни. Показано, что введение моноклональных антител к ИЛ-6 не только ингибирует плазмоклеточную пролиферацию миеломных клеток in vitro, но и дает противоопухолевый эффект у больных плазмоклеточным лейкозом.

Некоторые другие цитокины, такие как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ-5, также стиму­лируют пролиферацию плазматических клеток при миеломной болезни. ГМ-КСФ и ИЛ-1 усили­вают эффект ИЛ-6, а ИЛ-3 и ИЛ-5 сти­мулируют продукцию миеломными клетками ре­цепторов к ИЛ-6.

Ряд цитокинов, которые синтезируются мие­ломными клетками, способны влиять на различ­ные популяции клеток, играющих важную роль в патофизиологии ММ. Извест­но, что миеломные клетки продуцируют ИЛ-1β, фактор некроза опухоли ФНОα, функци­онально активный моноцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-КСФ). Все эти цитокины стимулируют стромальные клетки костного мозга, а также остеокласты, ответствен­ные за резорбтивные процессы в костях. В последние годы показано, что ИЛ-6 также спо­собен активировать остеокласты.

Другая группа цитокинов ингибирует рост миеломных клеток. ИЛ-4 также замедляет про­лиферацию миеломных клеток in vivo. На ранних стадиях заболевания определяется высо­кая концентрация ИЛ-2. Этот цитокин стимули­рует цитотоксические Т-лимфоциты к уничтоже­нию миеломных клеток. Выраженной антипролиферативной активностью обладает α-ин­терферон, наибольшая эффективность которо­го выявлена в фазе плато миеломной болезни. Таким образом, рост миеломы регулируется множеством цитокинов, как стимулирующих, так и ингибирующих опухолевую пролиферацию.

Важную роль в росте плазмоклеточных опухо­лей играет микроокружение стромальных клеток костного мозга. В культурах костномозговых стромальных клеток при ММ были идентифицированы четыре крупных попу­ляции клеток: фибробласты, миофибробласты, макрофаги и остеокласты. Стромальные клетки костного мозга секретируют большое количество белков адгезии, что позволяет им захватывать моноклональные клетки - предшественники плазматических клеток. Кроме того, стромальные клетки продуцируют цитокины и таким образом обеспечивают оптимальные усло­вия для локального роста и финальной дифференцировки плазматических клеток.

Несмотря на то, что результаты первого цитогенетического исследования ММ были опубликованы в 1959 году и с тех пор исследовано почти полторы тысячи образцов, мало известно о том, какие хромосомные нару­шения характерны для этого заболевания. Лишь у трети обследованных больных были выявлены клональные хромосомные изменения. Изучение кариотипа миеломных клеток значи­тельно затруднено из-за низкой пролиферативной активности патологических плазматических кле­ток и их предшественников.

Анеуплоидия наиболее характерна для ММ, причем встречается как гипо-, так и гипердиплоидия. Изменения в виде ги-пердиплоидии наиболее часто отмечаются в хро­мосомах 3, 5, 7, 9, 11, 19 и 21, а в виде гиподиплоидии - в хромосомах 13, 19 и X. Струк­турные аномалии наиболее часто касаются хро­мосомы 1 (42% описанных случаев). Точки раз­рывов могут возникать на любом плече хромосо­мы. Среди описанных транслокаций, наиболее общей специфической аномалией является транслокация (11;14)(q13;q32). Только она достоверно повторяется как основная хромосомная аномалия и отмечается даже в ло­кальных стадиях заболевания. По мнению ряда авторов, транслокация (11;14) являет­ся одной из причин злокачественной трансформа­ции при ММ. Выявление ее более важно на этапе ранней диагностики миело­мы и имеет меньшее значение при прогрессировании болезни.

Транслокация (11;14) вовлекает в процесс онкоген BCL-1 и обнаруживается также при дру­гих лимфопролиферативных заболеваниях. Впер­вые она была описана при лимфопролиферативном заболевании, сходным с хроническим лимфоцитарным лейкозом. Теперь эта хромосомная аномалия считается специфической для лимфомы зоны мантии и является наиболее характерной и для В-клеточного пролимфоцитарного лейкоза.

При ММ у больных с аномальным кариотипом прогноз хуже, чем у больных с нормальным кариотипом, но гиперплоидия прогностически более благоприят­на.

Как и при других опухолях, при ММ выявляется мутация гена - супрессора опухолевого роста р53. Частота мута­ций р53 в костном мозге больных со злокаче­ственными плазмоклеточными пролиферациями колеблется от 10 до 20% и обычно ассоцииру­ется с генерализованными или клинически агрес­сивными формами заболевания. Наиболее часто эта аномалия отмечается при плазмобластном лейкозе (до 22% случаев).

ММ является медленно пролиферирующей опухолью, что подтверждено при изучении пролиферативного индекса плазма­тических клеток. Index labeling (LI) - это про­цент активно пролиферирующих клеток, которые выявляются при включении радиоактивной мет­ки - 3Н-тимидина. Как показали исследования кинетики плазматических клеток, у больных с активно текущей миеломой только 1-3% плаз­матических опухолевых клеток находятся в фазе деления клетки (S-фаза). Клеточный цикл активно пролиферирующих клеток длится от 1 до 3 дней. При ММ плаз­матические клетки характеризуются низким уров­нем экспрессии Ki-67, маркера активного синте­за ДНК. Установлено, что у больных с низким индексом (менее 1%) хроническая фаза болезни может длиться от 1 до 10 лет и лечение заболевания в этой фазе, как правило, успешно. Уменьшение массы опухоли под влиянием тера­пии приводит к тому, что фаза терапевтического плато насту­пает несколько раньше, при уменьшении опухо­левой массы в 10-100 раз. В этой фазе миеломы количество парапротеина, определяемого в сыво­ротке и моче, соответствует остаточной массе опухоли.

Ответ на лечение, длительность фазы терапев­тического плато и выживаемость больных с ММ зависят от пролиферативной активности плазматических клеток. У боль­ных с низким пролиферативным индексом ответ на лечение появляется медленнее, но фаза тера­певтического плато и выживаемость дольше. У больных с высоким пролиферативным индексом (более 3%) и большой опухолевой массой отме­чается более быстрый ответ на лечение, но фаза терапевтического плато и выживаемость корот­кие. В этой группе больных чаще наблюдаются поражение мягких тканей и вовле­чение в процесс центральной нервной системы. Несмотря на стабиль­ную массу опухоли, в фазе терапевтического плато нередко отмечается увеличение пролиферирующей фракции в остаточной опухоли и проис­ходят дополнительные мутации, вследствие чего качество пролиферирующих клеток меняется - наступает рецидив заболевания, который менее чувствителен к лечению. Последующие ремиссии становятся все короче, пока не наступит резис­тентный рецидив - терминальная фаза болезни. В этой фазе синтез патологичес­кого протеина может снизиться или прекратить­ся. Вследствие опухолевой прогрессии и появле­ния мутантных клонов происходят качественные изменения парапротеина, у части больных - переключение с продукции тяжелых цепей на синтез легких. Развивается резистентность к лече­нию. Все эти данные позволили составить схему клинического течения миеломы.