Лабораторная диагностика чумы у человекаДля лабораторной диагностики чумы используют бактериоскопический, бактериологический, биологический, серологические и молекулярно-генетические методы. Диагноз чумы у человека ставится на основании выявления у него возбудителя – выделение и идентификация культуры, обнаружения специфического для чумного микроба антигена FI и специфических антител к антигену FI в сыворотках больных и переболевших. В качестве экспресс-методов используют иммунофлюоресцентный анализ (обнаружение микроба с помощью флюоресцирующих иммуноглобулинов), ПЦР (обнаружение микроба по наличию искомого участка ДНК в результате его многократного копирования), иммуносуспензионные методы – система 2-3 компонентных реакций с эритроцитарными диагностикумами или иммуноферментный анализ для обнаружения специфических антигенов чумного микроба. С этой же целью применяют и другие варианты иммуносуспензионных методов: дот-иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ. Все экспресс-методы выполняют после обеззараживания материала. Обязательному лабораторному исследованию подлежит материал: - от больных людей с симптомами болезни, сходными с клиническими проявлениями всех форм чумы; - лиц, контактировавших с больными легочной чумой; - лиц, участвовавших (без защитной одежды) во вскрытии трупов людей и верблюдов, погибших от чумы; - лиц, участвовавших в прирезке и разделке туши больного чумой верблюда и других животных, обработке мяса в процессе приготовления пищи, употреблявших в пищу мясо больных чумой животных; - лиц, совершивших аварию с разбрызгиванием заразного материала при работе с возбудителем чумы. Материал от больных, как правило, целесообразно брать сразу при поступлении в лечебное учреждение и спустя 3 дня после окончания специфического лечения антибиотиками с интервалами между очередными исследованиями 24 ч до получения трех отрицательных результатов. Материал от лиц, контактировавших с больными или контаминированными объектами – при поступлении в изолятор и по окончании профилактического лечения, перед выпиской. Исследованию подлежит: при легочной форме чумы – мокрота, при её отсутствии – мазок из зева, кровь из вены, моча; при септической форме – кровь, моча; при бубонной форме – пунктат бубона, кровь, моча; при кожной форме – отделяемое язвы, кровь, моча; при кишечной форме – кал, кровь, моча; при менингиальных явлениях – спинномозговая жидкость. У лиц, контактировавших с больным легочной формой чумы, а также в других случаях, если есть подозрение, что заражение произошло аэрогенным путем, исследуют мазок из зева. В остальных случаях у контактных исследования не проводят. Забор материала на исследование у больных с подозрением на чуму следует, как правило, проводить в условиях стационара до начала специфического лечения обученным квалифицированным медицинским персоналом под наблюдением специалиста противочумного учреждения или специалиста по особо опасным инфекциям ЦГиЭ субъекта Российской Федерации. В случае невозможности забрать материал в первые 2 ч после возникновения подозрения, лечение начинают по клиническим показаниям до забора материала. Забор материала у лиц, контактировавших с больными чумой и совершивших аварию, производят в изоляторе до начала профилактического лечения. Исследование материала проводят специалисты территориальных противочумных учреждений на своей базе, а также на базе лабораторий отделов особо опасных инфекций ФГУЗ ЦГиЭ субъекта Российской Федерации, если они соответствуют требованиям действующих "Санитарных правил безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патогенности". Специалисты отделов особо опасных инфекций проводят исследование обеззараженного материала экспресс-методами. Ведущим методом является люминесцентно-серологический. Определение антигена у больного возможно только при осложненной клинике в спинномозговой жидкости, в пунктате бубона – при тяжелом течении болезни, в моче – при всех формах болезни, начиная с 3-4 дня заболевания в низких титрах. Методы забора материала – в приложении 8. Запрещается давать окончательный (отрицательный или положительный) ответ на основании результатов экспресс-методов. Исследование материала от больного чумой. I этап: - приготовление мазков, окраска фиксированных мазков анилиновыми красителями, чумными флюоресцирующими иммуноглобулинами; - полимеразная цепная реакция; - посев на жидкие и плотные питательные среды со стимуляторами роста чумного микроба (кровь, моча, спинномозговая жидкость, пунктат бубона); - посев на плотные питательные среды со стимулятором роста чумного микроба и ингибиторами посторонней флоры (мокрота, мазок из зева, субстрат из вскрывшегося бубона, отделяемое язвы, моча, испражнения); - проба с диагностическими бактериофагами нативного материала на соответствующей плотной среде; - проба на чувствительность к антибиотикам с нативным материалом на плотной среде методом дисков; - поиск антигена FI иммуносуспензионными методами: реакция непрямой гемагглютинации, реакция нейтрализации антител, иммуноферментный анализ, дот-иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ (моча, спинномозговая жидкость, пунктат бубона); параллельно в качестве контроля ставят те же реакции с диагностикумами на другие инфекции (туляремия, бруцеллёз, холера и др.); - заражение лабораторных животных (морские свинки, белые мыши) внутрибрюшинно и подкожно (кровь, пунктат бубона, спинномозговая жидкость), подкожно и накожно (мокрота, мазок из зева, вскрывшийся бубон, отделяемое язвы, моча, испражнения). II этап (2-5 ч от начала исследования): - выдача предварительного положительного ответа на основании наличия в мазках биополярно окрашенных грамотрицательных овоидных палочек, их специфического свечения при окраске мазка флюоресцирующими чумными иммуноглобулинами, положительной ПЦР, положительных иммуносуспензионных реакций при отрицательных контролях. III этап (24-48 ч): - выдача подтверждения предварительного положительного ответа на основании наличия характерного роста на жидких и плотных питательных средах, наличия в мазках из этих сред грамотрицательных овоидных палочек с биполярным окрашиванием, положительной пробой с бактериофагами (лизис культуры чумными бактериофагами Покровской и Л-413С). Высев культуры для дальнейшей идентификации на питательный агар и агар с содержанием дефибринированной крови (5 %) для определения продукции FI после инкубации при 37° С. Одновременно выдача предварительного ответа о чувствительности выделенной культуры к антибиотикам. Посев культуры на среды Гисса с рамнозой, глицерином, сахарозой, арабинозой, ЦДС или среду Ленской для определения уреазной активности (после накопления чистой культуры). IV этап (3-7-е сутки): - выдача окончательного положительного ответа на основании выделения чистой культуры чумного микроба из посевов нативного материала, его идентификации по морфологическим, культуральным, биохимическим признакам, чувствительности к диагностическим бактериофагам, наличию специфических плазмид, а также на основании подтверждения диагноза выделением идентичных культур от павших или забитых лабораторных животных. V этап (5-8-е сутки): - выдача отрицательного ответа на основании отсутствия специфического роста на питательных средах при посеве нативного материала и органов забитых биопробных животных, отрицательной ПЦР, отрицательных иммуносуспензионных реакций с нативным материалом и органами забитых или павших биологических проб, отсутствия патологоанатомических изменений у последних, отсутствия в парных сыворотках больного специфических антител к чумному микробу. Исследование материала от лиц, контактировавших с больными легочной формой чумы, а также лиц, присутствовавших при аварии с разбрызгиванием заразного материала. Исследуемый материал – мазок из зева. I этап: - приготовление мазков, окраска анилиновыми красителями, флюоресцирующими чумными иммуноглобулинами; - полимеразная цепная реакция; - посев на плотные селективные среды; - заражение лабораторных животных подкожно и накожно. II этап (2-5 ч): - выдача предварительного положительного ответа на основании обнаружения специфически светящихся клеток в люминесцентном микроскопе, положительной ПЦР. III этап (48 ч): - выдача подтверждения предварительного положительного ответа на основании наличия характерных по морфологии колоний в посевах на плотной среде; - пересев колоний на питательный слабощелочной агар, на селективный агар и на агар с кровью для дальнейшей идентификации (последний посев ставят в термостат с 37° С для последующего определения F1); - при достаточном количестве колоний постановка пробы на чувствительность с диагностическими бактериофагами на плотной среде и пробы на чувствительность к антибиотикам методом дисков. IV этап (3-4-е сутки): - выдача положительного ответа на основании выделения типичной по морфологии культуры, лизирующейся диагностическими бактериофагами; - положительных иммуносуспензионных реакций на наличие антигена F1; - дальнейшая идентификация выделенной культуры. V этап (5-8-е сутки): - вскрытие забитых биопроб, их исследование бактериологически и серологически; - выдача окончательного положительного ответа на основании выделения и идентификации культуры чумного микроба, типичной по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, фаголизабельности, наличию специфических плазмид, подтверждения диагноза выделением идентичной культуры от павших или забитых биопробных животных (схема идентификации выделенных культур – в приложении 9; - выдача отрицательного ответа на основании отсутствия специфически светящихся клеток в мазках, окрашенных люминесцирующими чумными иммуноглобулинами, отрицательной ПЦР, отсутствия роста характерных по морфологии колоний на плотной среде, отсутствия характерных для чумы изменений в органах у биопробных животных и отсутствия специфического роста на плотной среде из посевов отпечатков их органов. Исследование материала от трупа человека, погибшего от чумы. Исследованию подлежат: кусочки паренхиматозных органов, легких из мест, где есть характерные для чумы изменения, лимфатические узлы, как регионарные к первичному аффекту, так и другие, увеличенные и имеющие изменения, сгустки крови из сердца и крупных сосудов, сыворотка крови, полученная из сгустков при их сокращении, участки любой ткани, имеющие изменения септического характера, спинномозговая жидкость, моча, содержимое кишечника, в случае наличия признаков загнивания трупа исследуют спинной и головной мозг. Исследования ведут по этапам, как исследование материала от больного чумой человека. Положительный предварительный диагноз может быть поставлен на любом этапе, так как при гибели от чумы все органы и ткани содержат большое количество возбудителя и его антигенов, в том числе FI. Поэтому весьма вероятен первый положительный ответ уже через 2 ч после исследования на основании наличия грамотрицательных биполярно окрашенных палочек, специфически светящихся в люминесцентном микроскопе при обработке мазков-отпечатков флюоресцирующим чумным иммуноглобулином, положительной ПЦР, высокого титра антигена FI в тканях и органах, наличия противочумных антител в сыворотке. Высокая вероятность подтверждения диагноза через 24-48 ч после начала исследования на основании обнаружения типичных по морфологии колоний чумного микроба, положительной пробы с бактериофагом, которую следует ставить на селективном агаре во избежании зарастания пятна лизиса культуры посторонней флорой и отрицательного ответа в 2-5 часов исследований Окончательный положительный ответ может быть поставлен через 48 ч – 6 сут. по результатам идентификации культуры чумного микроба и подтверждения ее выделением идентичной культуры от биопробного животного. Окончательный отрицательный диагноз дают на 5-8 сутки, как и при исследовании материала от больного. Запрещается выдавать отрицательный ответ по результатам ускоренного исследования и на основании результатов экспресс-методов.
|
