Работа № 1 Подсчет форменных элементов крови

Кровь состоит из жидкой части – плазмы и взвешенных в ней форменных элементов: эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов. Форменные элементы составляют около 45% объёма крови, остальные 55% приходятся на долю плазмы. Количество форменных элементов принято выражать их числом в 1 мкл.

Для подсчёта форменных элементов кровь, взятую из пальца, разбавляют в специальных смесителях (меланжерах), чтобы создать нужную концентрацию клеток, удобную для подсчёта. Заполняют разбавленной кровью счётную камеру и подсчитывают под микроскопом число форменных элементов.

Меланжер представляет собой пипетку с ампулообразным расширением. В ампуле находится стеклянная бусинка для лучшего размешивания крови. На капилляре нанесены две метки: 0.5 и 1; третья метка стоит за ампулообразным расширением: на меланжере для эритроцитов и тромбоцитов – 101, для лейкоцитов – 11. Последние метки указывают, во сколько раз объём ампулы больше объёма капилляра. Для разбавления крови для подсчёта эритроцитов применяют 3% гипертонический раствор хлорида натрия, в котором эритроциты сморщиваются; для подсчёта лейкоцитов применяют 5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовой синью. Кислота разрушает оболочки форменных элементов, а краска окрашивает ядра белых клеток. При этом эритроциты становятся невидимыми и не мешают подсчёту лейкоцитов.

Счётная камера представляет собой толстое предметное стекло, в средней части которого имеются 4 желобка. Между ними образуются 3 узкие пластинки. Средняя пластинка ниже боковых на 0.1мм и разделена пополам поперечными желобками. По обе стороны от желобка расположены сетки. Так как высота боковых пластинок на 0.1мм больше средней, то наложение на них покровного стекла над сеткой образуется камера глубиной в 0.1мм.

Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов (15х15). Каждый третий квадрат разделён дополнительно поперечными и продольными линиями на 16 маленьких квадратиков. Таких больших квадратов, разделённых на маленькие, в сетке 25. Сторона маленького квадратика равняется 1/20мм, площадь 1/20х1/20=1/400мм², так называемый «объём малого квадратика» равен 1/400х1/10=1/4000мм³.

Подсчёт эритроцитов.

Для работы необходимо: микроскоп, счётная камера Горяева, меланжеры для эритроцитов, скарификатор, 2 чашечки для разбавляющих жидкостей, вата, 3% раствор хлорида натрия.

Ход работы:

Берут заполненный меланжер для эритроцитов и, зажав концы его 3 и 1 пальцами, в течение 1 мин встряхивают его. Тотчас после тщательного перемешивания крови, выпустив предварительно наружу 1 -2 капли, наносят небольшую капельку на сетку камеры, предварительно путём притирания плотно закрытую покровным стёклышком. Излишек раствора при этом стекает в желобки. Если капля слишком велика, то жидкость может попасть на боковые пластинки камеры и высота слоя будет больше 0.1мм. В этом случае камеру следует промыть дистиллированной водой, насухо вытереть марлей и заполнить снова. Разведённую кровь следует ещё раз перемешать.

Заполнив камеру, ставят её под микроскоп и, если форменные элементы расположены равномерно (что является показателем хорошего перемешивания крови), приступают к подсчёту.

Считать эритроциты удобнее при большом увеличении (окуляр х7, объектив х40).

Чтобы получить удовлетворительные данные, необходимо подсчитать число эритроцитов в 5 больших квадратах, расположенных в разных местах сетки, например по диагонали. Рекомендуется вначале на листке бумаги нарисовать пять больших квадратов, разделить их на 16 маленьких и в каждый маленький квадратик вписать найденное число эритроцитов. Во избежание двукратного подсчёта клеток, лежащих на границах между малыми квадратиками, руководствуются правилом Егорова: «Относящимся к данному квадратику считаются эритроциты, лежащие как внутри квадратика, так и на его левой и верхней границе. Эритроциты, лежащие на правой и нижней границе в данном квадратике не обсчитываются». Подсчитав таким образом число эритроцитов (А) в 5 больших квадратов (что составляет 80 маленьких), находят среднее арифметическое число эритроцитов в одном маленьком квадратике А/80. Зная, что объём части камеры над одним маленьким квадратиком равен 1/4000мм³, умножают найденное число на 4000. Получается число эритроцитов в 1 мкл разведённой крови. Умножив на разведение – 200, получают количество в 1 мкл цельной крови. Таким образом, формула для вычисления количества эритроцитов следующая:

Х=А×400×200/80, где X – искомое число эритроцитов, А – число

эритроцитов в 80 маленьких квадратиках.

Подсчёт лейкоцитов

Цель работы: Ознакомление с методикой подсчета числа лейкоцитов.

Методика:Разводящей жидкостью для лейкоцитов служит 3% раствор уксусной кислоты. В пробирку наливают 0,4 мл разводящего раствора. Пипеткой от гемометра Сали набрать приготовленную кровь до метки, что соответствует 0,02 мл. Столбик крови должен быть цельным и не содержать пузырьков крови. Обтерев кончик капилляра ваткой перенести набранную кровь в пробирку с разводящим раствором. Тщательно перемешать. Разведение в пробирке 1:20.

Легким движениями больших пальцев обеих рук притереть покровное стекло к счетной камере до появления цветных ньютоновых колец. Стеклянной палочкой набрать каплю разведенной крови и поместить в счетную камеру (на кончик бороздки, находящейся сбоку от центральной пластинки камеры). Жидкость сама заполнит щель толщиной 0,1 мм между центральной пластинкой и покровным стеклом. Поставить камеру под малое увеличение микроскопа и приступить к подсчету.

Подсчитать число лейкоцитов В в 25 больших квадратах, что составляет 400 маленьких.

Среднее количество лейкоцитов в одном маленьком квадратике В/400. Зная, что объем части камеры над одним маленьким квадратиком равен 1/4000 мм3 умножить найденное число на 4000 и на 20,т.е. на разведение.

Х = (В х 4000 х 20) / 400, где Х - число лейкоцитов в 1 мм³ крови.

В норме число лейкоцитов в 1 л крови у человека 4,0 - 9,0 10⁹/л.

Вывод:

Рекомендации к оформлению работы.

Запишите количество ФЭК, содержащихся в 1 мкл исследованной крови. Объяснить принцип работы со счётной камерой и формулы для расчёта числа форменных элементов крови.