ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

 

Метод тонкослойной хроматографии основан на различной адсорб­ции составных частей смеси на выбранном адсорбенте. В качестве ад­сорбента используют бумагу, силикагели, крахмал, тальк, окись алюминия и другие материалы.

В последнее время все шире используют метод хроматографии в тонком слое пористого носителя (порошкообразного силикагеля или цел­люлозы), нанесенного на стеклянную пластину или алюминиевую фольгу. Этот метод требует незначительных количеств разделяемых веществ (0,01 - 0,005 мкг) и небольших затрат времени.

Нанесенные на силикагель аминокислоты (белковый гидролизат или смесь аминокислот-свидетелей) при пропускании через него органи­ческого растворителя переходят в подвижную фазу растворителя и, пе­ремещаясь вместе с ним с различной скоростью, разделяются. Скорость перемещения аминокислот зависит от химического состава аминокислот, от их способности растворяться в органическом подвижном растворителе и сорбироваться неподвижной фазой.

Для оценки степени распределения аминокислот на хроматограмме введен фактор разделения R_¦:

a

R_¦ =, (1)

b

 

где а - расстояние между линией старта и центром пятна аминокислоты на хро-

матограмме, мм;

b - расстояние между линией старта и фронтом растворителя, мм.

 

Чем больше растворимость аминокислот, например, в органическом растворителе, тем быстрее они движутся вслед за фронтом растворите­ля и тем большеу них величина R_f.

На величину R_f влияет природа адсорбента и растворителя (элюента), химическое строение аминокислот, температура и другие факто­ры. Величина R_f является характерной для каждой аминокислоты при данных условиях опыта.

Качественное определение аминокислот основано на проявлении хроматограммы нингидрином и сравнении R_f анализируемых аминокис­лот с R_f известных (стандартных) аминокислот, называемых «свиде­телями».

Для количественного определения аминокислот хроматографические пятна элюируют из слоя сорбента полярным растворителем, измеряют оптическую плотность окрашенных растворов и по калибровочному графику находят содержание аминокислот в исследуемом гидролизате или смеси аминокислот (см. работу 12).

 

 

Устройство для тонкослойной хроматографии представлено на рис.1.

 

 

Рис. 1. Устройство для тонкослойной хроматографии