ФОТОЭЛЕКТРОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

 

Самым распространенным химическим методом количественного оп­ределения белков является колориметрический метод, основанный на оптическом свойстве белков – поглощать свет. Светопоглощение белков выражается в единицах оптической плотности – D. Оптическая плотность измеряется при определенной длине волны на приборе фотоэлектроколориметре для окрашенных растворов белков или на спектрофотометре – для бесцветных белковых растворов. Оптическая плотность находится в прямо пропорциональной зависимости от концентрации белка в растворе. По закону Ламберта - Бэра эта зависимость имеет вид:

I₀

, (5)

I

где D – оптическая плотность;

I₀ – интенсивность падающего на исследуемый раствор света;

I − интенсивность света после прохождения через раствор;

ε − молярный коэффициент поглощения (т.е. это оптическая плотность

1 М раствора исследуемого белка в кювете с l=1 см), л ∙ моль^-1 ∙ см^-1;

С – концентрация белка в растворе, моль ∙ л^-1;

l − толщина поглощающего слоя раствора, см (зависит от толщины вы

бранной кюветы).

 

Если неизвестна молекулярная масса белка или необходимо определить концентрацию ряда белков в растворе (так называемый «общий белок»), то вначале необходимо построить градуировочный график. Для построения градуировочного графика готовят ряд растворов белка с заданными концентрациями. После проведения с ними цветной реакции, например биуретовой, измеряют оптическую плотность каждого из этих растворов и строят градуировочный график, откладывая по оси абсцисс известные концентрации белка, а по оси ординат - соответствующие полученные на колориметре значения оп­тической плотности (рис. 7).

 

 

Рис.7. Градуировочный график для определения содержания белка

 

 

Если известна молекулярная масса чистого белка, то можно экспериментально определить исходя из формулы 5, либо найти в литературе его молярный коэффициент поглощения ε;. Далее, определив оптическую плотность исследуемого раствора белка, можно, исходя из формулы 5, рассчитать его концентрацию. Например, для фермента пепсина с молекулярной массой 35 000 коэффициент поглощения ε = 1360 л ∙ моль^-1 ∙ см^-1. Величину D = 0,4 для раствора пепсина неизвестной концентрации определили на колориметре в кювете с толщиной слоя l=1 см. Тогда исходя из формулы 5 неизвестная концентрация пепсина в растворе будет равна:

 

D 0,4

С= = = 0,0003 М/л

ε ∙ l 1360 10