Ход работы. 1. 1 г дрожжей вносят в центрифужную пробирку, помещенную в стаканчик со льдом, добавляют 4 мл 10 %-го холодного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ)

1. 1 г дрожжей вносят в центрифужную пробирку, помещенную в стаканчик со льдом, добавляют 4 мл 10 %-го холодного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Смесь растирают стеклянной па­лочкой в течение 15 мин для разрушения клеток дрожжей. Полученный гомогенат центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в пробирку через воронку с фильтром.

2. В две пробирки вносят по 1 мл полученного трихлоруксусного экстракта, содержащего органические и неорганические фосфаты. (Орга­нический фосфат - это остатки фосфорной кислоты, входящие в состав АТФ, АДФ и других фосфорилированных нуклеотидов. Неорганический фосф ат - это свободная фосфорная кислота и её соли.). В третью про­бирку вносят 1 мл дистиллированной воды - эта проба является конт­рольной.

3. Одну опытную пробирку подвергают гидролизу. Для гидролиза в пробирку с опытной пробой добавляют 1 мл 2 н соляной кислоты и нагревают смесьна кипящей водяной бане в течение 7 мин.

4. Вторая пробирка с трихлоруксусным экстрактом служит для количественного определения неорганического фосфата. В эту пробир­ку также наливают 1 мл 2 н соляной кислоты, но гидролизу не под­вергают.

5. Для проведения цветной реакции в каждую из трех пробирок добавляют по 0,4 мл раствора молибдата аммония и по 0,4 мл 1 %-го раствора аскорбиновой кислоты. Пробирки помещают в термостат при температуре 37 °С на 5 мин, после чего охлаждают в воде со льдом в течение 3-5 мин.

6. Объем растворов во всех пробирках доводят дистиллированной водой до 6 мл, тщательно перемешивают и определяют оптическую плот­ность окрашенных растворов на фотоэлектроколориметре против конт­рольной пробы при l = 640 нм (при красном светофильтре) в кювете толщиной 5 мм.

7. Содержание фосфора до и после гидролиза АТФ находят по найденным значениям оптической плотности D по градуировочному гра­фику (рис. 8).

 

8. Определив количество неорганического фосфора до и после гидролиза АТФ, можно рассчитать содержание аденозинтрифосфата (АТФ) в дрожжах по формуле:

 

507 ∙ (a – b) ∙ 4

Х = ∙ 100 [мг%], (8)

62 ∙ 1000 ∙ 1

 

где 507 − молекулярная масса АТФ, г;

62 − молекулярная масса двух атомов фосфора в остатках фосфорной

кислоты АТФ, г;

а − количество неорганического фосфора после гидролиза АТФ, мкг;

b − количество неорганического фосфора до гидролиза АТФ, мкг;

1000 − коэффициент перевода мкг в мг;

4 − объем трихлоруксусного экстракта дрожжей, мл;

1 − навеска дрожжей, г

 

Рис.8. Градуировочный график для определения фосфора

Контрольные вопросы

1. В чем состоит биологическая роль АТФ?

2. С какой целью к дрожжам добавляют раствор трихлоруксусной кислоты?

3. Какие превращения происходят с АТФ при кипячении трихлоруксусного дрожжевого экстракта в соляной кислоте?

4. Какая цветная реакция положена в основу количественного определения фосфора?