Оптимизация процесса разделения

Выбор подвижной фазы. В отличие от газовой хроматографии, где для достижения приемлемого разделения газ-носитель оставляют одним и тем же, а варьируют полярность неподвижной фазы, в жидкостной хроматографии, как правило, изменяют полярность, и как следствие, элюирующую силу подвижной фазы. Это гораздо легче сделать, чем менять колонки. Поэтому выбор подвижной фазы является важной частью разработки методик разделения в жидкостной хроматографии.

В большинстве случаев при использовании чистого растворителя нельзя добиться эффективного разделения соединений. В этом случае переходят к смесям двух или нескольких растворителей. Так, если обозначить растворитель с меньшей элюирующей силой А, а с большей – В, то для достижения эффективного разделения надо экспериментально подобрать оптимальное содержание В в смеси. Прежде всего, нас интересуют два фактора оптимизации разделения: фактор удерживания k, т.е. параметр полярности, и фактор разделения α, т.е. коэффициент селективности. Мы будем подбирать растворители с такой элюирующей силой, чтобы все значения k для всех элюируемых веществ попадали в диапазон от 1 до 20. Однако, добиваясь приемлемого удерживания, нельзя забывать о том, что разделение большинства хроматографических пиков должно быть как можно более полным (по возможности до базовой линии). Например, если мы добились неполного разделения пиков при содержании растворителя В 35%, то изменив его содержание до 40 или 45%, удается получить лучшее разделение хроматографических зон веществ и, следовательно, улучшить разрешение. Однако, в свою очередь, это может привести к более значительному перекрыванию зон других компонентов.

В качестве примера рассмотрим процесс оптимизации хроматографического разделения смеси веществ при использовании в качестве подвижной фазы смесей ACN/H₂O, MeOH/H₂O и ACN/MeOH/H₂O. Пусть при использовании в качестве ПФ смеси, состоящей из 80% ACN и 20% H₂O, разделение соединений происходит за приемлемое время (факторы удерживания попадают в требуемый диапазон), однако факторы удерживания соединений имеют близкие значения, следовательно, разделение при этом далеко не полное. При уменьшении содержания ACN до 40% факторы удерживания увеличиваются, но разделение некоторых компонентов все еще неполное. Переход от ACN к 50% МеОН позволил полностью разделить неразделенные ранее компоненты, но при этом зоны других веществ начинают перекрываться. Наконец, при использовании смеси двух растворителей (смесь 1:1 применяемых ранее 40% ACN и 50% MeOH) достигается некоторое усредненное разделение при допустимом разрешении пиков.

Предложенный эмпирический подход при выборе состава подвижной фазы работает в большинстве случаев.

Градиентное элюирование. Градиентное элюирование в ЖХ является наиболее эффективным путем разделения аналитов с достаточно различающимися временами удерживания. При изократическом элюировании часто наблюдается недостаточное разрешение пиков слабоудерживаемых веществ либо, в случае длительного удерживания компонентов, уширение хроматографических зон.