ДНК-маркеры, основанные на анализе рестрикционного полиморфизма

Открытие и выделение рестрицирующих эндонуклеаз (рестриктаз) [16], расщепляющих ДНК в участках со строго определенной последовательностью, позволило разработать маркеры на основе анализа рестрикционного полиморфизма ДНК. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, англ. RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism). Впервые ПДРФ был использован как генетический маркер в 1974 г. при идентификации термо-чувствительной мутации в геноме аденовируса [37]. Однако широкое применение вариантов полиморфизма ДНК в качестве генетических маркеров началось с 1980 г. после выхода основополагающей работы Ботштейна с соавт. [22], в которой были изучены свойства ПДРФ как генетического маркера, дано теоретическое обоснование его использования и предложен метод оценки уровня информативности (PIC - polymorphism information content). Самими авторами метод был с успехом применен для картирования генома человека [22]. ПДРФ используют для анализа полиморфизма конкретных локусов (генов). Способ анализа ПДРФ сводится к обработке ДНК рестриктазами с последующим электрофоретическим разделением полученной смеси и определением длин рестрикционных фрагментов после блот-гибридизации со специфическим меченым зондом. Так как рестрицирующие эндонуклеазы имеют строго специфические места расщепления, то генетические различия в нуклеотидной последовательности ДНК между индивидуумами (т.е. полиморфизм на уровне ДНК) приведут к различному распределению сайтов рестрикции вдоль соответствующих молекул ДНК и получению продуктов рестрикции, в которых длина гомологичных фрагментов будет различаться. Таким образом, полиморфизм ДНК будет тестироваться как ПДРФ. Подробнее с методологией ПДРФ можно ознакомиться в многочисленных обзорах [2, 10, 20, 21 и др.].

Основной причиной, приводящей к возникновению полиморфизма ДНК, первоначально считались точковые мутации (а также микроделеции и инсерции), затрагивающие сайты узнавания тех или иных эндонуклеаз рестрикции [22]. В последующих работах спектр возможных причин был расширен, и в настоящее время основная роль отводится таким факторам, как крупные делеции и вставки [89], трансверсии, транслокации, транспозиции мобильных генетических элементов [77] и т.п. Кроме того, некоторые рестриктазы не способны расщеплять ДНК, если сайт узнавания содержит один или несколько метилированных цитозиновых остатков. Такие ферменты также могут выявить полиморфизм, если имеются вариации в характере метилирования (цит. по [9]).

С использованием ПДРФ-маркеров были получены первые успешные результаты по построению молекулярно-генетических карт многих видов растений и животных, накоплены обширные сведения о генетическом полиморфизме различных организмов, выявлены ассоциации с хозяйственно-полезными признаками [20, 21, 26, 76, 78, 81]. Важным достоинством данного типа маркеров является высокая воспроизводимость результатов, а также кодоминантный тип наследования. ПДРФ-локусы могут обладать множественными аллелями, что повышает их информативность. ПДРФ-анализ митохондриальной ДНК и кластера генов, кодирующих рибосомные РНК (рДНК), широко используется в популяционной генетике, биогеографических и филогенетических исследованиях [18]. Высокий консерватизм ПДРФ-маркеров позволяет использовать их при сравнительном картировании родственных видов. Например, появление детальных генетических карт многих растений позволило сравнить между собой ряд геномов, благодаря использованию общего набора ПДРФ-зондов [63].

ДНК-фингерпринт (синоним - "геномная дактилоскопия") позволяет исследовать полиморфизм множества локусов повторяющихся последовательностей (мультилокусный анализ). Анализ проводится тем же способом, что и в случае ПДРФ, но в качестве специфического гибридизационного зонда используются последовательности повторяющихся последовательностей - минисателлитов. Минисателлиты диспергированы по геному и представляют собой последовательности, состоящие из многократно повторенной единицы ("мотива" или "коровой" последовательности) длиной от 9 до 100 и более п.н. (тандемно повторяющиеся последовательности). Отдельные последовательности отличаются друг от друга по общей длине (числу повторов "мотива"), а также по некоторым вариациям в нуклеотидной последовательности "мотива". Использование "коровых" последовательностей в качестве зондов при гибридизации позволяет выявлять множество участков рестрикционного полиморфизма и получать высокоспецифическую картину гибридизации геномной ДНК, характерную для конкретного индивида (особи). Показано, что с помощью данного подхода в геноме млекопитающих можно выявить более 30 высокополиморфных локусов, что достаточно для индивидуальной идентификации человека, растений, животных) [6, 48, 87]. Многие "коровые" минисателлитные последовательности высоко консервативны и могут быть использованы для выявления аналогичных последовательностей в ДНК самых разных организмов [6, 47, 87].

Описаны минисателлитные зонды не только универсального характера, но и локус-специфичные [42]. Локус-специфичные минисателлиты можно получить также клонированием экстрагированных из геля фрагментов, дающих отдельную полосу на фингерпринте ДНК [96]. Монолокусные минисателлиты высокоинформативны и могут быть эффективно использованы для анализа групп сцепления генов.

Основными механизмами возникновения и поддержания полиморфизма в минисателлитах считаются неравный кроссинговер и генная конверсия. При этом высокую вариабельность (нестабильность) минисателлитов связывают не с внутренним свойством повторяющейся последовательности, а с инициатором мутаций, фланкирующим повтор [24], и активацией мутагенных систем генома [48]. Скорость мутационного процесса в гипервариабельных минисателлитных локусах человека выше, чем в целом для геномной ДНК, и составляет в среднем на гамету 10-4 на 1 т.п.н. минисателлита [48]. В силу чрезвычайно высокого полиморфизма этот тип маркеров не применяется в популяционных или филогенетических исследованиях, а используется для индивидуальной идентификации человека, растений и животных.

К недостаткам методов рестрикционного анализа с использованием блот-гибридизации (ПДРФ, минисателлиты), ограничивающим их распространение, следует отнести применение радиоактивных изотопов, длительность и трудоемкость процедуры, необходимость использования для анализа больших количеств ДНК высокого качества.