Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Ферментатівний| антіоксидантний| захист




Доверь свою работу кандидату наук!
Поможем с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой

 

1.1 Механізм дії та характеристика пероксидаз

Утворившись в процесі диспропорціювання аніон-радикалу кисню пероксид водню може утилізуватися за допомогою двох ферментів: каталази (КФ 1.11.1.6) і глутатіонпероксидази (КФ 1.11.1.9).

Каталаза прискорює розкладання пероксиду водню з утворенням молекулярного кисню і води:

2O2 → 2Н2O + O2

Найбільша каталазна активність виявлена в печінці, крові (еритроцитах) і нирках. У головному мозку каталаза практично відсутня. Каталітична активність цього ферменту надзвичайно висока. Одна молекула каталази може розкласти за секунду 44000 молекул пероксиду водню. У присутності ферменту реакція майже не вимагає енергії активації і її швидкість визначається швидкістю дифузії субстрату до активного центру ферменту. Проте каталаза характеризується великою величиною Km, і ефективне розкладання пероксиду водню відбувається тільки при його високій концентрації. Тому в клітині максимальна каталазна активність характерна для місць з високою продукцією Н2O2, наприклад пероксисомах. Захист каталази від високих концентрацій власного субстрату, мабуть, забезпечується НАДФН. Кожна субодиниця тетрамерної молекули каталази здатна зв'язувати молекулу відновленого нікотинамідаденіндинуклеотидфосфату, який перешкоджає утворенню неактивної форми ферменту під дією Н2O2. Основну роль в детоксикації пероксиду водню в клітині грає глутатіонпероксидаза. Експериментальні результати, підтверджуючи цей висновок, отримані на культивованих ендотеліальних клітинах, епітеліальних клітинах слизової оболонки шлунку і печінки щурів in vitro.

 

1.2 Супероксиддисмутаза

Для локалізації і обмеження зони дії фізіологічно значущих біорадикалів і детоксикації біорадикалів, що виникають нефізіологічним шляхом, у аеробних організмів в ході еволюції сформувалася складна захисна система, що включає ферменти і низькомолекулярні сполуки.

Ключовим ферментом антиокисної захисної системи є супероксиддисмутаза (КФ 1.15.1.1), що каталізує реакцію диспропорціонування аніон-радикалів кисню:

O2•- + O2•- +2Н+ → Н2О2 + О2

Вперше супероксиддисмутазна активність була виявлена Мак-Кордом і Фрідовічем в 1969 році. Вони показали, що прискорення реакції є фізіологічною функцією купрумвмісного білка еритрокупреіну (гемокупреіну), відомого з 1938 року. Оскільки, окрім іона купруму, відкритий Мак-Кордом і Фрідовічем фермент містив цинк, він був названий — купрум-, цинк-вмісна супероксиддисмутаза. Сu-, Zn-СОД складається з двох субодиниць, кожна з яких має молекулярну масу 16300 кДа. Константа швидкості реакції у присутності Сu-, Zn-СОД рівна 2 • 109 М-1с-1 і не залежить від величини рН в інтервалі 4,8—10,2. Дещо пізніше були виявлені марганець-вмісний і ферум-вмісний ферменти.

Сu-, Zn-СОД присутній у всіх еукаріотичних клітинах, де міститься в основному в цитозолі . Деяка кількість цього ферменту знаходиться в лізосомах і пероксисомах. Ферум-вмісний фермент знайдений тільки у прокаріотів. Марганець-вмісний СОД присутній у прокаріотів і в мітохондріях еукаріотичних клітин [16]. Проте попередник мітохондріальної Mn-СОД синтезується в цитозолі, в мітохондріях відбувається лише відщеплення від нього поліпептидного фрагменту.

Вміст ізоферментів супероксиддисмутази в окремих органах і тканинах експериментальних тварин істотно розрізняється. Найбільш високий рівень Сu-, Zn-СОД виявлений в печінці (до 350 мкг/г маси тканини), нирках (185 мкг/г маси тканини) і підшлунковій залозі (165 мкг/г маси тканини). У серці, мозку і еритроцитах вміст цього ізоферменту складає близько 60—70 мкг/г маси тканини (клітин). Найменший рівень супероксиддисмутазної активності виявлений в м'язовій і жировій тканині [1-4]. Активність Mn-СОД знижується в ряду: серце, нирки, печінка, мозок, підшлункова залоза, м'язова і жирова тканина. У еритроцитах Mn-СОД відсутній. У окремих органах також існують відмінності в розподілі супероксиддисмутазної активності. Наприклад, в мозку гліальні клітини містять супероксиддисмутази в шість разів більше, ніж нейрони.

З віком, в процесі індивідуального розвитку організму, питома активність супероксиддисмутази в печінці, серці і мозку мишей знижується, хоча зниження активності в серці і мозку компенсується збільшенням кількості ферменту. Є дані, що з віком загальна супероксиддисмутуюча активність в мозку може навіть збільшуватися. Одна з причин, що обумовлює зниження питомої активності СОД, може бути трансляційна постмодифікація білку в результаті його неферментативного глікозилювання.

На теперішній час створено декілька препаратів на основі антиоксидантного ферменту супероксиддисмутази - ерисод і орготеін. Дія супероксиддисмутази полягає в перетворенні супероксид аніон-радикалу на перекис водню, а каталаза сприяє розпаду перекису водню до молекул води. Перевагою даних препаратів є їх мала токсичність, як ендогенних сполук. До недоліків відноситься можливість розвитку алергічних реакцій із-за білкової природи препаратів (потрібне введення пробних доз), а також їх досить висока вартість. Крім того, не завжди виражена ефективність даних засобів унаслідок їх недостатньої біодоступності, обумовленої великим розміром молекули ферментів. Для збільшення біодоступності і ефективності робляться спроби створити ліпосомальну лікарську форму супероксиддисмутази. Теоретично найбільш виправданим є поєднане вживання як супероксиддисмутази, так і каталази, оскільки вони каталізують послідовно протікаючі реакції нейтралізації активних форм кисню .

1.3 Біохімічна роль ферментів глутатіонового циклу

Вперше глутатіон-залежний фермент, що захищає в еритроцитах гемоглобін від пошкоджувальної дії пероксиду водню, був виявлений G. С. Mills в 1957 р. В даний час встановлено, що молекула «класичної» глутатіонпероксидази є тетрамером, що складається з ідентичних субодиниць. Молекулярна вага всієї молекули близько 85 кДа, однієї субодиниці — 21 кДа. Кожна субодиниця ферменту містить один атом селену у вигляді селеноцистеіну. Як донор водню глутатіонпероксидаза використовує тільки відновлений глутатіон, проте фермент володіє широкою субстратною специфічністю відносно відновлюваного субстрату і окрім пероксиду водню, здатний каталізувати двохелектронне відновлення різних органічних гідропероксидів, у тому числі і гідропероксидів вільних поліненасичених жирних кислот :

2GSH + Н2O2 → GSSG + 2Н2O;

2GSH + ROOH → GSSG + ROH + Н2O.

Гідропероксидні групи поліненасичених жирних кислот, що входять до складу молекул фосфоліпідів, не є субстратом для класичної селен-вмісної глутатіонпероксидази .

Кінетика дії селен-вмісної глутатіонпероксидази відповідає механізму подвійного заміщення або пінг-понг механізму. Сумарна реакція включає ряд елементарних стадій:

E-CysSe-+ + ROOH → E-CysSeOH + ROH;

E-CysSeOH + GSH → E-CysSe-SG + H2O;

E-CysSe-SG + GSH → E-CysSe- + H+ + GSSG.

Константи швидкості другого порядку реакції глутатіонпероксидази з печінки хом'яка з різними гідропероксидами дорівнює: для гідропероксиду t-бутилу — 7,06 • 105 мМ-1хв-1; гідропероксиду кумилу — 1,04 • 106 мМ-1хв-1; гідропероксиду лінолевої кислоти — 2,36 • 106 мМ-1хв-1; пероксиду водню — 2,98 • 106 мМ-1хв-1 [9].

Вміст глутатіонпероксидази в різних тканинах організму зменшується в ряду: печінка > еритроцити > нирки > шлунок > серце = легені = мозок > плазма > м'язи. Близько 75 % глутатіонпероксидазної активності використовується в цитоплазмі клітин, решта кількості ферменту локалізована в мітохондріях. У плазмі крові виявлений ізофермент, що відрізняється імунологічно від внутріклітинної глутатіонпероксидази. Подібно до позаклітинної СОД апофермент плазматичної форми є глікопротеїдом. Показано, що існують вікові і добові (циркадні) зміни активності глутатіонпероксидази в різних тканинах експериментальних тварин [29]. В період зниження активності глутатіонпероксидази в серці відмічена активація процесів перекисного окиснення ліпідів [39].

Рівень глутатіонпероксидази в тканинах надзвичайно чутливий до аліментарного надходження селену в організм. Утримання тварин протягом декількох тижнів на Se-дефіцитній дієті призводить до різкого зниження глутатіонпероксидазної активності і пропорційного зменшення тканинного рівня відповідного імуноактивного білку. Ступінь зниження активності ферменту неоднаковий в різних тканинах, які по чутливості до дефіциту селену розташовуються таким чином: плазма → печінка → нирки → серце = легені → еритроцити .

В даний час захисну роль глутатіонпероксидази розглядають в двох аспектах. По-перше, фермент здатний відновлювати пероксид водню, запобігаючи його залученню до реакції Фентона і інгібуючи вільнорадикальні процеси на стадії ініціації. По-друге, відновлюючи гідропероксиди поліненасичених жирних кислот, глутатіонпероксидаза блокує вільнорадикальні процеси на стадії розгалуження ланцюга. Оскільки «класична» глутатіонпероксидаза не здатна відновлювати гідропероксиди жирних кислот, що входять до складу ліпідів біологічних мембран, то для реалізації її захисної дії необхідна участь фосфоліпази А2, що каталізує гідроліз фосфоліпідів. Протіканню цієї реакції сприяє та обставина, що окиснені жирні кислоти відщеплюються фосфоліпазою А2 значно швидше, ніж неокиснені. Крім того, фосфоліпаза А2 активується продуктами вільнорадикального окиснення. Найефективніше гідролізуються фосфоліпазою А2 фосфатидилетаноламін і фосфатидилхолін, що є основними субстратами реакцій перекисного окиснення ліпідів в біологічних мембранах.

Слід зазначити, що фосфоліпаза А2, зокрема мітохондріальний фермент, надає нітромембранну дію, тобто каталізує гідроліз ліпідів, розташованих з нею на одній мембрані. Гідроліз екзогенних ліпідів відбувається після їх зв'язування з клітинними мембранами.

У організмі глутатіонпероксидаза функціонує не тільки як компонент захисної антиокиснювальної системи, але і грає важливу роль в процесах біосинтезу простагландинів і лейкотрієнів.

Разом з «класичною» селен-залежною глутатіонпероксидазою, в організмі присутній ряд інших ферментів, що виконують схожу функцію. До таких ферментів відносяться глутатіонтрансферази (глутатіон-S-трансферази) (КФ 2.5.1.18). Окрім реакцій кон'югації глутатіону з численними електрофільними субстратами, глутатіонтрансферази каталізують реакції відновлення органічних гідропероксидів, включаючи пероксиди фосфоліпідів, ендопероксиди (епоксиди), але неактивні відносно гідропероксиду водню. Оскільки до складу глутатіонтрансферази селен не входить, її часто називають селен-незалежна глутатіонпероксидаза. Найбільша селен-незалежна глутатіонпероксидазна активність виявлена в печінці, значно нижчий вміст ферменту в легенях і серці. Глутатіонтрансфераза виділена також з еритроцитів і клітин шкіри. У гепатоцитах близько 80 % глутатіонтрансферази (близько 10 % всього розчинного білку) знаходиться в цитоплазмі, решта кількості майже рівномірно розподілена між мікросомами, зовнішньою мембраною мітохондрій і ядрами. Цитоплазматична глутатіонтрансфераза є сімейством ізоферментів, які розділяють залежно від величини значення рI на три класи: Alpha (основні), Мі (нейтральні) і Pi (кислі) [22]. Всі цитозольні форми є димерами, що складаються з однакових або гетерогенних субодиниць з молекулярною масою близько 25 кДа. Мікросомальний (мембранозв'язний) фермент — зазвичай тример або тетрамер, що складається з субодиниць з молекулярною масою 17 кДа. Функціональні властивості субодиниці в димері не залежать від природи сусіднього поліпептиду як відносно каталітичної активності, так і відносно чутливості до дії інгібіторів. Значні відмінності в каталітичних властивостях початкових субодиниць обумовлюють існування широкого спектру ізоферментів глутатіонтрансферази, що відрізняються по ступеню пероксидазної активності. При дослідженні тварин на селен-дефицитній дієті спостерігається збільшення активності всіх ізоферментів глутатіонтрансферази, що є, компенсаторною реакцією на зменшення в тканинах рівня глутатіонпероксидази]. Проте наслідки недоліку селену в їжі свідчать, що антиокиснювальна функція глутатіонпероксидази компенсується глутатіонтрансферазою не повністю. Разом з тим в деяких органелах, наприклад ядрах, глутатіонтрансфераза грає важливу роль в запобіганні ушкоджувальній дії на пероксиди ліпідів.

Близько двадцяти років тому було показано, що в цитоплазмі печінки і еритроцитах щурів присутній глутатіон-залежний білковий чинник, що інгібує перекисне окиснення ліпідів, навіть у відсутність фосфоліпази А2. Спочатку його пов'язували з цитоплазмою глутатіонтрансферазою. Проте виявилось, що, подібно селен-вмісної глутатіонпероксидазі, селен-незалежний фермент цитоплазми інгібірує перекисне окиснення ліпідів тільки за наявності умов для гідролізу ліпідів і вивільнення гідропероксидів ненасичених жирних кислот з мембран. У подальших дослідженнях було показано присутність в цитоплазмі клітин печінки, серця і мозку білку, здатного ефективно відновлювати гідропероксиди фосфоліпідів без їх попереднього гідролізу. Виділений з серця свиней білок, названий глутатіонпероксидазою гідропероксидів фосфоліпідів, виявився мономером з молекулярною масою 23 кДа. Фермент містить один атом селену на молекулу білку і каталізє відновлення гідропероксидів водню, лінолевої кислоти і фосфатидилхоліну у присутності відновленого глутатіону, з константами швидкостей реакції другого порядку, рівними відповідно: 1,8 • 105 мМ-1хв-1; 1,8 • 106 мМ-1хв-1; 8,0 • 105 мМ-1хв-1. Схожа по структурі і субстратній специфічності мономерна глутатіонпероксидаза була виділена з печінки щурів. При дослідженні тканинного розподілу мономірної глутатіонпероксидази максимальна активність виявлена в печінці і нирках. Значно нижче активність ферменту в серці, легенях і мозку. Мінімальний рівень мономерної глутатіонпероксидази характерний для м'язів. Істотних вікових змін в активності ферменту не виявлено.

Встановлено, що мономерна глутатіонпероксидаза інгібірує фотосенсибілізоване окиснення ліпідів еритроцитів, повністю відновлюючи гідропероксиди фосфоліпідів і холестерину без їх попереднього гідролізу. «Класична» глутатіонпероксидаза інгібірувала цей процес тільки у присутності фосфоліпази А2, при цьому гідропероксиди холестерину не відновлювалися.

Сімейство глутатіонпероксидаз є прикладом найбільш філогенетично старих білків. Вони виявлені у бактерій і простих. У хребетних відомо чотири гени, контролюючих синтез різних селен-вмісних ферментів. Окрім розглянутих вище «класичної», плазматичної і мономерної глутатіонпероксидаз, особливий ізофермент знайдений в шлунково-кишковому тракті. Амінокислотна послідовність у всіх ферментів, за винятком мономерної глутатіонпероксидази, співпадає приблизно на 90%, тоді як гомологія між «класичною» і мономерною глутатіонпероксидазою — менше 30 %. Така значна відмінність в амінокислотній послідовності цих білків указує, що розбіжність між відповідними генами почалася близько мільярда років назад. Найбільш консервативним фрагментом у глутатіонпероксидаз є каталітичний центр, що складається з селеноцистеіну, триптофану і глутаміну]. Його висока стійкість філогенезу обумовлена, мабуть, ідеальним виконанням своїх функцій, що виключає одноелектронне перенесення і утворення радикальних і інших високоактивних інтермедіатів, як це характерно для гемвмісних і селен-незалежної пероксидаз. Дивергенція селен-вмісних ферментів проходила у напрямі зміни субстратної специфічності зв'язуючої ділянки. Вища його ліпофільність у глутатіонпероксидази фосфоліпідів обумовлена відсутністю залишків аргініну в цьому локусі.

Для ефективного функціонування різних глутатіонпероксидаз необхідний високий рівень відновленого глутатіону. Зокрема, мономерна глутатіонпероксидаза відновлює гідропероксиди в модельних умовах при 1 -3 мМ концентрації GSH. Тому в клітині глутатіон знаходиться, головним чином, у відновленій формі. Наприклад, для еритроцитів відношення GSH/GSSG близько до 10. Високе співвідношення GSH/GSSG підтримується завдяки активності глутатіонредуктази (КФ 1.6.4.2), ферменту того, що каталізує реакцію:

GSSG + НАДФН + Н+ = 2GSH + НАДФ+ ;

In vitro єдиним субстратом для глутатіоредуктази є НАДФН [43]. У зрілих еритроцитах регенерація НАДФН можлива тільки в результаті глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної реакції пентозофосфатного циклу. Каталізує цю реакцію фермент глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа (КФ 1.1.1.49) функціонує в еритроцитах як один з ключових елементів антиокисної захисної системи. Існують численні експериментальні докази, що генетично обумовлений дефіцит глюкозо-6-фосфатдегідрогенази корелює з підвищеною чутливістю еритроцитів до гемолітичної дії ксенобіотиків, бактероцидних і вірусних інфекцій, стресу.







Дата добавления: 2015-10-12; просмотров: 813. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2022 год . (0.015 сек.) русская версия | украинская версия








Поможем в написании
> Курсовые, контрольные, дипломные и другие работы со скидкой до 25%
3 569 лучших специалисов, готовы оказать помощь 24/7