Сравнительное исследование флавоноидного состава травы зверобоя пятнистого и зверобоя продырявленного методом ВЭЖХ
Исследованию подвергались воздушно-сухие образцы зверобоя пятнистого и зверобоя продырявленного, заготовленные в фазу цветения (июль 2008 г.). Заготовку осуществляли в Республике Марий Эл и Самарской области. В качестве веществ сравнения использовали достоверно известные рабочие стандартные образцы (РСО) гиперозида, рутина, кверцетина и бисапигенина. В ходе сравнительных исследований качественного и количественного флавоноидного состава методом ВЭЖХ использовали водно-спиртовые извлечения, полученные из травы зверобоя пятнистого и зверобоя продырявленного с использованием 70% этилового спирта. Сравнительный фитохимический анализ осуществляли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе «Милихром-5» в изократическом режиме (колонка КАХ 6-80-4 №6 25.01.99, стационарная фаза – «Seporon C18»). В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и воды в различных соотношениях с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты. Скорость потока элюента в анализе составляла 0,1 мкл/мин. Достоверность идентификации пиков на хроматограммах подтверждали путем использования в методиках анализа соответствующего внутреннего стандартного вещества. Значения времени удерживания пиков индивидуальных веществ представлены в таблице 3 и 4 и на хроматограмме извлечений. Таблица 3 Время удерживания пиков веществ травы зверобоя продырявленного
Таблица 4 Время удерживания пиков веществ травы зверобоя пятнистого
Детекцию осуществляли при пяти длинах волн: 254; 270; 290; 330; 360 нм. Исследования по подбору оптимальных условий разделения показали, что элюирующая система растворителей в соотношении 25:75 ацетонитрила и воды с добавлением 1% уксусной кислоты позволяет разделять и детектировать в сравниваемых объектах три доминирующих флавоноидных соединеня: рутин гиперозид и кверцетин (рис. 9 и 10).
Рис. 9. Хроматограмма извлечения из травы зверобоя пятнистого Обозначения пиков: 1 – рутин; 2 – гиперозид; 3 – кверцетин
В области соответствующего времени удерживания для РСО рутина (пик №1) в аналогичных условиях хроматографирования в траве зверобоя пятнистого обнаружен незначительный пик данного вещества (рис.9). Известно, что для травы зверобоя продырявленного характерно наличие флавоноида бисапигенина (Куркин В.А., Правдивцева О.Е., 2008), однако в условиях системы растворителей 25:75 ацетонитрила и воды с добавлением 1% уксусной кислоты бисапигенин не обнаруживается ни в зверобое продырявленном, ни в зверобое пятнистом (рис.9 и 10).
Рис. 10. Хроматограмма извлечения из травы зверобоя продырявленного Обозначения пиков: 1 – рутин; 2 – гиперозид; 3 – кверцетин
В этой связи проведены дополнительные исследования по подбору оптимальных условий хроматографирования, позволяющие детектировать наличие бисапигенина в траве зверобоя продырявленного (рис. 11). Однако в случае зверобоя пятнистого бисапигенин не обнаружен (рис. 12). Следовательно, наличие бисапигенина характерно лишь для травы зверобоя продырявленного. Установлено, что доминирующим флавоноидом извлечений из травы зверобоя пятнистого является гиперозид (пик № 2), тогда как рутин определен лишь в следовых количествах (рис.9). Что касается зверобоя продырявленного, то в извлечениях из сырья данного растения преобладает рутин (пик 1) на фоне достаточно высокого содержания гиперозида (пик 2) (рис. 10). Кверцетин (пик 3) обнаружен в обоих видах (рис. 9 и 10), однако содержание данного компонента невысокое.
Рис. 11. Хроматограмма извлечения из травы зверобоя продырявленного Обозначения пиков: 1 – рутин; 2 – гиперозид; 3 – кверцетин; 4 - бисапигенин
Рис. 12. Хроматограмма извлечения из травы зверобоя пятнистого Обозначения пиков: 1 – рутин; 2 – гиперозид; 3 – кверцетин
Принимая во внимание то обстоятельство, что флавоноидный состав зверобоя продырявленного и зверобоя пятнистого имеет некоторые различия, представляет интерес количественная оценка уровня содержания флавоноидов в исследуемых видах зверобоя. С целью количественного определения содержания отдельных флавоноидов разработана методика ВЭЖХ-анализа. Методика количественного определения содержания флавоноидов в траве зверобоя пятнистого и зверобоя продырявленного. Около 1 г (точная навеска) воздушно-сухого образца измельченного сырья с размером частиц, проходящих через сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещали в колбу с притертой крышкой емкостью 100 мл, добавляли 40 мл 70% этилового спирта. Колбу взвешивали на тарирных весах с точностью до ± 0,01 г и присоединяли к обратному холодильнику. Экстракцию осуществляли при нагревании на кипящей водяной бане в течение 60 мин. Извлечение охлаждали, доводили на тарирных весах до первоначальной массы 70% этиловым спиртом и фильтровали через бумажный фильтр с красной полосой. 5 мкл полученного извлечения вводили в хроматограф «Милихром-5» и хроматографировали со скоростью потока 0,1 мл/мин. Детекцию анализируемых веществ проводили при аналитической длине волны λmax 360 нм. Анализ осуществляли в трех повторностях. Параллельно осуществляли анализ растворов РСО рутина, кверцетина, гиперозида, бисапигенина при длине волны 360 нм. Содержание флавоноидов в процентах (Х) в траве зверобоя пятнистого и зверобоя продырявленного в пересчете на абсолютно сухое сырьё и соответствующий стандарт вычисляли по формуле:
Н – значение высоты пика определяемого флавоноида на хроматограмме испытуемого раствора; Н РСО – значение высоты пика на хроматограмме раствора соответствующего РСО; VК – объём разведения пробы, мл; VП – объём пробы раствора, вводимого в колонку, мкл; m – масса сырья, г; mРСО – масса РСО, г Установлено, что содержание доминирующего флавоноида – гиперозида в траве зверобоя пятнистого составляет в среднем 6,50±0,01%, в траве зверобоя продырявленного – 2,50±0,01%%. Рутин присутствует в следовых количествах в траве зверобоя пятнистого, тогда как в зверобое продырявленном его содержание достигает 1,30±0,01%%. Содержание кверцетина в обоих видах невысокое и составляет для зверобоя продырявленного – до 0,40±0,01%%, для зверобоя пятнистого – до 0,23±0,01%%. Бисапигенин не выявлен в образце травы зверобоя пятнистого, тогда как в траве зверобоя продырявленного его содержание составляет около 1,05±0,01%%.
|
где
