Техника выполнения. Щелочной гидролиз. Экстракции жирорастворимых витаминов из образца продукта предшествует щелочной гидролиз
Щелочной гидролиз. Экстракции жирорастворимых витаминов из образца продукта предшествует щелочной гидролиз, что вызвано необходимостью удаления жиров и гидролиза эфиров токоферолов и ретинола. Щелочной гидролиз проводят в присутствии антиоксиданта. Навеску образца, величина которой зависит от предполагаемого содержания витаминов в продукте (для витамина А – навеска 1...20 г с содержанием витамина 2...25 мкг, для витамина Е – навеска 1...15 г с содержанием витамина 20... 100 мкг, для (β – каротина – навеска 1...15 г с содержанием (β – каротина 10...50 мкг), берут с точностью до 0> 01 г, помещают в круглодонную колбу, соединенную шлифом с обратным холодильником, добавляют 40...60 см3 этилового спирта и 0, 2 г аскорбиновой кислоты. При анализе сухих продуктов перед внесением этилового спирта к навеске добавляют воду в двукратном количестве, тщательно перемешивают материал стеклянной палочкой и оставляют на 15 мин, периодически помешивая. Затем в колбу вносят 50 % раствор КОН, количество которого зависит от вида продукта, количества и состава в нем жира. При анализе продуктов с низким содержанием жира (менее 6 %) на 10 г образца добавляют 2...4 см3 щелочи. При более высоком содержании жира в продукте (6...40 %) количество добавляемой щелочи численно равно величине навески. Для продуктов с высоким содержанием жира (> 40 %) (масло сливочное и др.) на навеску образца 3...5 г берут 4…8 см3 щелочи. После добавления щелочи смесь кипятят 30 мин на водяной бане с обратным водяным холодильником, охлаждают, переливают в делительную воронку и добавляют воду до окончательной концентрации спирта около 30...35 %. Признаком полного омыления служит то, что после добавления воды смесь остается прозрачной. При образовании мути необходимо повторить омыление с новой навеской, увеличив количество щелочи для омыления. Смесь после омыления экстрагируют диэтиловым эфиром 4 раза: сначала объемом, равным объему добавленной воды, а затем объемами на 20 % меньшими. Колбу после омыления ополаскивают эфиром. Объединенный эфирный экстракт отмывают от щелочи водой, контролируя рН по фенолфталеину. К экстракту добавляют 8...10 г безводного Na2S04; выдерживают 20...30 мин в темном месте и медленно фильтруют через слой безводного Na2S04 в круглодонную колбу, промывая Na2S04 и фильтр эфиром. Затем весь эфир отгоняют под вакуумом на ротационном испарителе при температуре не выше 25...30 0С, причем последние капли эфира лучше удалять с помощью продувки азотом. Сухой неомыляемый остаток немедленно растворяют в 5... 10 см3 гексана или в объеме растворителя, используемого в качестве подвижной фазы, с тем чтобы концентрация витамина А была в пределах 3...5 мкг/мл, витамина Е – 15...25 мкг/мл. При содержании в анализируемом продукте стеринов в экстракте по мере охлаждения выпадает осадок, вначале в виде хлопьев. В этом случае экстракт необходимо поставить в ледяную баню и оставить на 1...2 ч в холодильнике до полного выпадения осадка. Прозрачный экстракт в охлажденном состоянии осторожно сливают в другую пробирку. Определение витамина А: Для приготовления стандартного раствора взвешивают 0, 0200 г ретинола или 0, 0250 г ацетата витамина А с точностью до 0, 0001 г, растворяют в этиловом спирте и доводят объем в мерной колбе до 100 см3 (основной стандартный раствор). В мерную колбу на 100 см3 переносят 2 см3 раствора и доводят объем этиловым спиртом (рабочий стандартный раствор). Содержание витамина А в рабочем растворе в пересчете на ретинол – приблизительно 4...4, 5 мкг/мл (13...15 МЕ/мл). При использовании в качестве стандарта раствора ацетата витамина А в масле навеску препарата рассчитывают исходя из требуемой концентрации рабочего раствора. Стандартный раствор хранят при +4 0С в течение 10 дней. В день использования определяют концентрацию в рабочем стандартном растворе, измеряя оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 324 нм в кювете с длиной I = 1 см и проверяя чистоту стандартного раствора хроматографически (на хроматограмме должен присутствовать один пик витамина, помимо пиков не удерживаемых на колонке примесей, содержащихся в растворителе). Расчет: Содержание витамина А в мкг/мл рассчитывают по формуле:
где: D – оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 324 нм относительно этилового спирта; 1000 – содержание витамина А в 1 мл 1 % раствора, мкг; При использовании в качестве стандарта ацетата витамина А содержание в растворе пересчитывают на витамин А (ретинол) по формуле:
где: 0, 87 – коэффициент пересчета на ретинол. При использовании в качестве стандарта ацетата витамина А к навеске образца одного из исследуемых продуктов добавляют точный объем рабочего стандартного раствора ацетата витамина А (навеска образца должна быть равна навеске образца без добавления стандартного раствора). Затем навеску образца с добавленным стандартным раствором подвергают щелочному гидролизу и проводят экстракцию так же, как описано выше для навески испытуемого образца. Сухой неомыленный остаток растворяют в том же объеме растворителя. В этом случае навеску образца, объем рабочего стандартного раствора, добавляемого к навеске, объем растворителя для растворения неомыляемого остатка рассчитывают исходя из того, что приблизительная концентрация витамина в испытуемом растворе должна быть около 3 мкг/мл, в растворе образца с добавленным стандартным раствором около 5 мкг/мл. При использовании обращеннофазовой хроматографии придерживаются следующих условий анализа: Þ объем проб, вводимый в колонку – 10 мкл; Þ состав подвижной фазы метанол – вода (98: 2) или ацетонитрил-вода (95: 2) в объемных %; Þ скорость подачи подвижной фазы – 100 мкл/мин для микроколоночного хроматографа «Милихром» и 1, 0 мл/мин для стандартных жидкостно-хроматографических систем. Þ в качестве неподвижной фазы рекомендуются колонки с сорбентом на основе силикагеля с привитыми октадецильными группами (ОДС или С18); Силасорб С18, размер частиц – 5...7 мкм. Þ типовой размер колонок – 62x2 мм или 80x2 мм для микроколоночного хроматографа; колонки Ultrasphere ODS (250x4, 6 мм); Nucleosil С18 (250x4, 6 мм) – для стандартного хроматографа; Þ детекторы. Определение витамина А проводят с использованием ультрафиолетового (А. = 324 нм) или флуориметрического (α 1 = 324, α 2 = 480 нм) детекторов. Þ время удерживания ретинола должно находиться в пределах 3...5 мин, если оно находится в больших пределах, то при приготовлении элюента следует увеличить в нем количество метилового спирта или ацетонитрила на 1 %. Если не удалось добиться нужной элюирующей силы подвижной фазы, добавляют еще 1 % модифицирующего растворителя. И так повторяют, пока не добьются нужного результата. Если же время удеживания находится в меньших пределах, то при приготовлении' элюента аналогично увеличивают количество воды. При использовании нормальнофазовой хроматографии придерживаются следующих условий анализа: Þ состав подвижной фазы смесь гексана или гептана с небольшим содержанием изопропанола (1... 1, 5 %) или метанола (0, 5...1 %). Þ колонки с сорбентом на основе силикагеля различных марок – «Силасорб», «Сепарон», «Партисил», «Зорбакс» и др. Þ время удерживания ретинола в этих условиях должно составлять 8...15 мин. Þ детекторы. Определение проводят с использованием ультрафиолетового (X = 326 нм) или флуориметрического (к1 = 324, к2 = 480 нм) детектора. Þ Идентификация. В инжектор жидкостного хроматографа вводят последовательно равные объемы испытуемого и стандартного растворов. Пик витамина на хроматограмме испытуемого раствора идентифицируют путем сравнения со временем удерживания пика витамина на хроматограмме стандартного раствора. Расчет: Содержание витамина А в продукте (мг/100 г) определяют по результатам двух хроматографических анализов, его рассчитывают по формуле:
где: Нис – средняя высота (или площадь) пика витамина на хроматограмме пробы испытуемого раствора, мм или мм2; Нст – средняя высота (или площадь) пика витамина на хроматограмме стандартного раствора, мм или мм2; Сст – количество витамина в растворе стандарта, введенного в колонку, мкг; V1 – общий объем испытуемого раствора, мл; V2 – объем испытуемого раствора, вводимый в колонку хроматографа, мл; α – навеска образца пищевого продукта, г; 100 – пересчет на 100 г пищевого продукта; 1000 – пересчет на мг.
Результаты определений рассчитывают до третьей значащей цифры. За результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений. Определение витамина Е. Для определения массовой доли витамина Е (суммы, α – β –, ᵞ –, ʸ –токоферолов) экстракт токоферолов после щелочного гидролиза вводят в детектор жидкостного хроматографа. Количественное определение проводят по интенсивности поглощения или флуоресценции. Приготовление стандартного раствора α -токоферола. Для приготовления стандартного раствора взвешивают 0, 0400 г α -токоферола с точностью до 0, 0001 г, растворяют в этиловом спирте и доводят объем в мерной колбе до 100 см3. Срок годности данного раствора при температуре +4°0С – 10 дней. Приготовление рабочего стандартного раствора α -токоферола. В мерную колбу на 100 см3 переносят 5, 0 см3 раствора и доводят этиловым спиртом до метки. Срок годности данного раствора при температуре +4°0С – 10 дней. Приготовление рабочего стандартного раствора на основе α -токоферилацетата. При использовании в качестве стандарта α -токоферилацетата его подвергают щелочному гидролизу. Взвешивают 0, 0400 г α -токоферилацетата с точностью до 0, 0001 г, растворяют в этиловом спирте и доводят объем в мерной колбе до 100 см3. К 5 мл полученного раствора добавляют 15 см3 этилового спирта, 0, 1 г аскорбиновой кислоты, 1 см3 50 % раствора КОН, кипятят 15...20 мин на водяной бане с обратным водяным холодильником и экстрагируют. После отгонки эфира остаток растворяют в 100 см3 абсолютного спирта (рабочий стандартный раствор). В день использования в рабочем стандартном растворе определяют концентрацию α -токоферола, измеряя оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 292 нм в 1 см:
где: D – оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 292 нм, в кювете сравнения – этиловый спирт; 1000 – содержание α -токоферола в 1 мл 1 % раствора, мкг;
В рабочем стандартном растворе содержание α -токоферола должно быть около 20 мкг/мл. Чистоту стандартного раствора проверяют спектрофотометрически (максимум при 292...294 нм) и хроматографически (на хроматограмме один пик, помимо пиков не удерживаемых на колонке примесей, содержащихся в растворителях). Условия хроматографического анализа для метода обращенно-фазовой хроматографии: Ø микроколоночный хроматограф «Милихром», Ø микроколонка (62x2 мм или 80x2 мм) с сорбентом «Силасорб» С18; Ø объем пробы, вводимый на колонку, 10 мкл; Ø подвижная фаза – 98 % водный раствор метилового спирта или 95 % водный раствор ацетонитрила; Ø скорость подачи подвижной фазы – 100 мкл/мин. Определение α – токоферола проводят с использованием ультрафиолетового (А = 292 нм) или флуориметрического детекторов. Время выхода α -токоферола должно находиться в пределах 9...15 мин. Для определения суммы Р, α -токоферолов необходимо наличие стандартных растворов этих форм. Условия хроматографического анализа для метода нормально-фазовой хроматографии: Ø микроколонки с силикагелем марки «Силасорб»; Ø подвижная фаза гексан или гептан с небольшим содержанием изопропанола (1...1, 5 %) или метанола (0, 5...1 %), Ø время выхода из колонки α -токоферола – в пределах 3...5 мин. При определении только токоферолов при наличии в экстракте ретинола необходимо проводить элюирование до выхода пика ретинола из колонки, иначе при повторном анализе он будет мешать при определении токоферола. При совместном определении витамина А и Е детектирование следует проводить в двухволновом режиме (292 и 324 нм) детектирования. Кроме того, в условиях нормально-фазовой хроматографии разные формы витамина Е разделяются на отдельные пики, т.е. может быть получено четкое разделение 8 форм (4 токоферола и 4 токотриенола). В связи с этим необходимы стандартные растворы этих форм для их идентификации. Проведение хроматографического анализа заключается в том, что в колонку жидкостного хроматографа вводят последовательно равные объемы испытуемого и стандартного растворов. Пик витамина на хроматограмме испытуемого раствора идентифицируют путем сравнения со временем удерживания пика витамина на хроматограмме стандартного раствора. Содержание витамина в образце определяют по результатам двух хроматографических анализов. Расчет: Содержание токоферола в образце в мг на 100 г продукта определяют по формуле:
где: D – оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 292 нм, в кювете сравнения – этиловый спирт; 1000 – содержание α -токоферола в 1 мл 1 % раствора, мкг; Вычисления проводят до третьей значащей цифры. За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение (X) результатов двух параллельных определений. Определение β -каротина следует проводить в условиях нормально – фазовой ВЭЖХ на сорбентах типа «Силасорб», «Сепарон», «Нуклеосил» и других с размером частиц 5 мкм на микроколонках 62x2 или 80x2 мм. Подготовку образцов и стандартных растворов выполняют аналогично, как для витаминов А и Е. Þ Подвижная фаза – гексан или гептан с небольшим содержанием (0, 1 %) 2 – пропанола. Þ Оптимальный расход подвижной фазы составляет 100 мкл/мин, Þ объем вводимой пробы – 5 мкл, Þ аналитическая длина волны – 450 или 480 нм (детектор видимой области спектра), скорость движения диаграммы самописца – 0, 3 см/мин. Если в наличии имеется только УФ – детектор, в качестве аналитической применяют длину волны 290 нм. В условиях стандартной ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектором, имеющим сменные фильтры, оптимальным является фильтр с длиной волны 436 нм. В этом случае можно использовать обращенно-фазовую ВЭЖХ на сорбенте «Силасорб» С18, 5... 10 мкм, размер колонки – 250x3 мм, с элюентом состава метанол – ацетонитрил – хлороформ (47: 47: 6), расход элюента – 1 мл/мин. Время анализа – 15 мин. Работа 2.2.3. Определение витаминов А и Е фотометрическим методом Определение содержания ретинола-ацетата (витамина А) и токоферола-ацетата (витамина Е) ведут фотометрическим методом по ГОСТ Р 52147-2003 «Белково-витаминно-минеральные и амидо-витаминно-минеральные добавки». Сущность метода заключается в омылении образца водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов диэтиловым эфиром, разделении витаминов хроматографией на колонке с окисью алюминия и количественном определении витаминов фотометрическим методом.
Приготовление раствора хлорного железа массовой долей около 0, 2 % в абсолютированном спирте. Навеску реактива массой 0, 2 г растворяют в 99, 8 см3 абсолютированного этилового спирта. Раствор хранят в холодильнике в склянке из темного стекла не более 7 сут. Приготовление раствора фенантролина или, дипиридила массовой долей около 0, 5 % в абсолютированном этиловом спирте. Навеску реактива массой 0, 500 г растворяют в 99, 5 см3 абсолютированного этилового спирта. Раствор хранят в холодильнике в склянке из темного стекла не более 7 сут. Приготовление безводного сернокислого натрия. Реактив высушивают в сушильном шкафу при температуре (105 ± 2) 0С в течение 3 ч, хранят в склянке с притертой пробкой. Приготовление окиси алюминия. Реактив прокаливают в муфельной печи при температуре (400 ± 10) 0С в течение 4 ч, охлаждают до комнатной температуры в эксикаторе. К 97 г реактива добавляют 3 см дистиллированной воды и тщательно перемешивают. После отстаивания в течение не менее 3 ч реактив годен к использованию. Реактив хранят в склянке с притертой пробкой. Приготовление раствора α -токоферола массовой концентрации 1 мг/см3. Навеску токоферола-ацетата массой 0, 1120 г в расчете на содержание чистого вещества помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см3 добавляют от 100 до 200 мг аскорбиновой кислоты, 50 см3 этилового спирта и 10 см3 раствора гидроокиси калия массовой долей 50 %. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают в водяной бане при температуре (85 ± 2) 0С в течение 25 мин. Затем содержимое колбы быстро охлаждают под струей водопроводной воды до комнатной температуры, переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, приливают по 50 см3 дистиллированной воды и диэтилового эфира, встряхивают и отстаивают до разделения слоев. После расслаивания нижний водно-спиртовый слой сливают в коническую колбу, а эфирный слой оставляют в делительной воронке. В коническую колбу приливают 50 см3 диэтилового эфира, встряхивают, отстаивают и после расслаивания верхний эфирный слой присоединяют к эфирному экстракту в делительной воронке, а к водно-спиртовому слою в конической колбе снова приливают 50 см3 диэтилового эфира и проводят экстракцию, как было указано выше. После расслаивания эфирный слой из конической колбы снова присоединяют к экстракту в делительной воронке. Объединенные эфирные экстракты промывают дистиллированной водой порциями по 30 см3 до исчезновения розовой окраски промывных вод по реакции с фенолфталеином. Промытый экстракт переносят в коническую колбу вместимостью 250 см3, пропуская его через бумажный фильтр и слой безводного сернокислого натрия (10…15 г). После окончания фильтрации сернокислый натрий три раза промывают порциями (по 20…30см) диэтилового эфира. Эфир отгоняют в водяной бане при температуре не выше 50 0С в токе азота или под вакуумом, используя водоструйный насос или роторный испаритель. К сухому остатку приливают 10…15 см3 абсолютированного этилового спирта, количественно переносят раствор в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем в колбе до метки этим же спиртом и тщательно перемешивают. Приготовление раствора α -токоферола массовой концентрации 20 мкг/см3. 1 см3 раствора α -токоферола массовой концентрации 1 мг/см3 переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят объем в колбе абсолютированным спиртом до метки и тщательно перемешивают. В полученном растворе проверяют массовую концентрацию α -токоферола и его чистоту, снимая спектр в пределах 260–310 нм на спектрофотометре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см относительно абсолютированного этилового спирта. Чистый α -токоферол имеет симметричный пик максимумом поглощения при длине волны 292 нм. Массовую концентрацию α -токоферола в растворе CE, мкг/см3, вычисляют по формуле:
где: D – оптическая плотность раствора при длине волны 292 нм; 106 – коэффициент пересчета граммов в микрограммы; E1%1cм – оптическая плотность раствора α -токоферола в абсолютированном этиловом спирте массовой концентрации 1 г в 100 см3 при длине волны 292 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см. Построение градуировочного графика для определения токоферола-ацетата (витамина Е). В пять мерных пробирок вместимостью по 5 см3 приливают 0, 5; 1, 0; 2, 0; 3, 0 и 4, 0 см3 раствора α -токоферола массовой концентрации 20 мкг/см3. В первые четыре пробирки добавляют 3, 5; 3, 0; 2, 0 и 1, 0 см3 абсолютированного этилового спирта. Затем в пробирки добавляют по 0, 5 см раствора ο -фенантролина и по 0, 5 см3 раствора хлорного железа, перемешивают. Ставят опытную пробу в темное место на 5 мин для развития окраски. По истечении времени измеряют оптические плотности испытуемых растворов в порядке возрастания их концентрации на фотоэлектроколориметре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм при длине волны (520 ± 25) нм относительно абсолютированного этилового спирта. Одновременно проводят контрольное испытание на реактивы без внесения α -токоферола. По полученным данным строят градуировочный график, откладывая на оси ординат значения разности оптической плотности испытуемых растворов и контрольного раствора, на оси абсцисс – содержание α -токоферола, мкг/5 см3(10, 20, 40, 60 и 80 мкг/5 см3). Приготовление элюирующих растворов Приготовление раствора I. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 6 см3 диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают. Приготовление раствора II. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 12 см3 диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают. Приготовление раствора III. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 30 см3 диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.
|