Студопедия — Техника выполнения. Щелочной гидролиз. Экстракции жирорастворимых витаминов из образца продукта предшествует щелочной гидролиз
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Техника выполнения. Щелочной гидролиз. Экстракции жирорастворимых витаминов из образца продукта предшествует щелочной гидролиз






Щелочной гидролиз. Экстракции жирорастворимых витаминов из образца продукта предшествует щелочной гидролиз, что вызвано необходимостью удаления жиров и гидролиза эфиров токоферолов и ретинола. Щелочной гидролиз проводят в присутствии антиоксиданта.

Навеску образца, величина которой зависит от предполагаемого содержания витаминов в продукте (для витамина А навеска 1...20 г с содержанием витамина 2...25 мкг, для витамина Е навеска 1...15 г с содержанием витамина 20... 100 мкг, для (β каротина навеска 1...15 г с содержанием (β каротина 10...50 мкг), берут с точностью до 0> 01 г, помещают в круглодонную колбу, соединенную шлифом с обратным холодильником, добавляют 40...60 см3 этилового спирта и 0, 2 г аскорбиновой кислоты. При анализе сухих продуктов перед внесением этилового спирта к навеске добавляют воду в двукратном количестве, тщательно перемешивают материал стеклянной палочкой и оставляют на 15 мин, периодически помешивая. Затем в колбу вносят 50 % раствор КОН, количество которого зависит от вида продукта, количества и состава в нем жира. При анализе продуктов с низким содержанием жира (менее 6 %) на 10 г образца добавляют 2...4 см3 щелочи. При более высоком содержании жира в продукте (6...40 %) количество добавляемой щелочи численно равно величине навески. Для продуктов с высоким содержанием жира (> 40 %) (масло сливочное и др.) на навеску образца 3...5 г берут 4…8 см3 щелочи.

После добавления щелочи смесь кипятят 30 мин на водяной бане с обратным водяным холодильником, охлаждают, переливают в делительную воронку и добавляют воду до окончательной концентрации спирта около 30...35 %. Признаком полного омыления служит то, что после добавления воды смесь остается прозрачной. При образовании мути необходимо повторить омыление с новой навеской, увеличив количество щелочи для омыления.

Смесь после омыления экстрагируют диэтиловым эфиром 4 раза: сначала объемом, равным объему добавленной воды, а затем объемами на 20 % меньшими. Колбу после омыления ополаскивают эфиром. Объединенный эфирный экстракт отмывают от щелочи водой, контролируя рН по фенолфталеину. К экстракту добавляют 8...10 г безводного Na2S04; выдерживают 20...30 мин в темном месте и медленно фильтруют через слой безводного Na2S04 в круглодонную колбу, промывая Na2S04 и фильтр эфиром. Затем весь эфир отгоняют под вакуумом на ротационном испарителе при температуре не выше 25...30 0С, причем последние капли эфира лучше удалять с помощью продувки азотом. Сухой неомыляемый остаток немедленно растворяют в 5... 10 см3 гексана или в объеме растворителя, используемого в качестве подвижной фазы, с тем чтобы концентрация витамина А была в пределах 3...5 мкг/мл, витамина Е 15...25 мкг/мл. При содержании в анализируемом продукте стеринов в экстракте по мере охлаждения выпадает осадок, вначале в виде хлопьев. В этом случае экстракт необходимо поставить в ледяную баню и оставить на 1...2 ч в холодильнике до полного выпадения осадка. Прозрачный экстракт в охлажденном состоянии осторожно сливают в другую пробирку.

Определение витамина А: Для приготовления стандартного раствора взвешивают 0, 0200 г ретинола или 0, 0250 г ацетата витамина А с точностью до 0, 0001 г, растворяют в этиловом спирте и доводят объем в мерной колбе до 100 см3 (основной стандартный раствор). В мерную колбу на 100 см3 переносят 2 см3 раствора и доводят объем этиловым спиртом (рабочий стандартный раствор). Содержание витамина А в рабочем растворе в пересчете на ретинол приблизительно 4...4, 5 мкг/мл (13...15 МЕ/мл).

При использовании в качестве стандарта раствора ацетата витамина А в масле навеску препарата рассчитывают исходя из требуемой концентрации рабочего раствора. Стандартный раствор хранят при +4 0С в течение 10 дней. В день использования определяют концентрацию в рабочем стандартном растворе, измеряя оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 324 нм в кювете с длиной I = 1 см и проверяя чистоту стандартного раствора хроматографически (на хроматограмме должен присутствовать один пик витамина, помимо пиков не удерживаемых на колонке примесей, содержащихся в растворителе).

Расчет:

Содержание витамина А в мкг/мл рассчитывают по формуле:

,

где: D – оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 324 нм относительно этилового спирта;

1000 содержание витамина А в 1 мл 1 % раствора, мкг;

При использовании в качестве стандарта ацетата витамина А содержание в растворе пересчитывают на витамин А (ретинол) по формуле:

,

где: 0, 87 коэффициент пересчета на ретинол.

При использовании в качестве стандарта ацетата витамина А к навеске образца одного из исследуемых продуктов добавляют точный объем рабочего стандартного раствора ацетата витамина А (навеска образца должна быть равна навеске образца без добавления стандартного раствора). Затем навеску образца с добавленным стандартным раствором подвергают щелочному гидролизу и проводят экстракцию так же, как описано выше для навески испытуемого образца. Сухой неомыленный остаток растворяют в том же объеме растворителя.

В этом случае навеску образца, объем рабочего стандартного раствора, добавляемого к навеске, объем растворителя для растворения неомыляемого остатка рассчитывают исходя из того, что приблизительная концентрация витамина в испытуемом растворе должна быть около 3 мкг/мл, в растворе образца с добавленным стандартным раствором около 5 мкг/мл.

При использовании обращеннофазовой хроматографии придерживаются следующих условий анализа:

Þ объем проб, вводимый в колонку 10 мкл;

Þ состав подвижной фазы метанол вода (98: 2) или ацетонитрил-вода (95: 2) в объемных %;

Þ скорость подачи подвижной фазы 100 мкл/мин для микроколоночного хроматографа «Милихром» и 1, 0 мл/мин для стандартных жидкостно-хроматографических систем.

Þ в качестве неподвижной фазы рекомендуются колонки с сорбентом на основе силикагеля с привитыми октадецильными группами (ОДС или С18); Силасорб С18, размер частиц 5...7 мкм.

Þ типовой размер колонок 62x2 мм или 80x2 мм для микроколоночного хроматографа; колонки Ultrasphere ODS (250x4, 6 мм); Nucleosil С18 (250x4, 6 мм) для стандартного хроматографа;

Þ детекторы. Определение витамина А проводят с использованием ультрафиолетового (А. = 324 нм) или флуориметрического (α 1 = 324, α 2 = 480 нм) детекторов.

Þ время удерживания ретинола должно находиться в пределах 3...5 мин, если оно находится в больших пределах, то при приготовлении элюента следует увеличить в нем количество метилового спирта или ацетонитрила на 1 %. Если не удалось добиться нужной элюирующей силы подвижной фазы, добавляют еще 1 % модифицирующего растворителя. И так повторяют, пока не добьются нужного результата. Если же время удеживания находится в меньших пределах, то при приготовлении' элюента аналогично увеличивают количество воды.

При использовании нормальнофазовой хроматографии придерживаются следующих условий анализа:

Þ состав подвижной фазы смесь гексана или гептана с небольшим содержанием изопропанола (1... 1, 5 %) или метанола (0, 5...1 %).

Þ колонки с сорбентом на основе силикагеля различных марок «Силасорб», «Сепарон», «Партисил», «Зорбакс» и др.

Þ время удерживания ретинола в этих условиях должно составлять 8...15 мин.

Þ детекторы. Определение проводят с использованием ультрафиолетового (X = 326 нм) или флуориметрического (к1 = 324, к2 = 480 нм) детектора.

Þ Идентификация. В инжектор жидкостного хроматографа вводят последовательно равные объемы испытуемого и стандартного растворов. Пик витамина на хроматограмме испытуемого раствора идентифицируют путем сравнения со временем удерживания пика витамина на хроматограмме стандартного раствора.

Расчет:

Содержание витамина А в продукте (мг/100 г) определяют по результатам двух хроматографических анализов, его рассчитывают по формуле:

,

где: Нис средняя высота (или площадь) пика витамина на хроматограмме пробы испытуемого раствора, мм или мм2;

Нст средняя высота (или площадь) пика витамина на хроматограмме стандартного раствора, мм или мм2;

Сст количество витамина в растворе стандарта, введенного в колонку, мкг;

V1 общий объем испытуемого раствора, мл;

V2 объем испытуемого раствора, вводимый в колонку хроматографа, мл;

α навеска образца пищевого продукта, г;

100 пересчет на 100 г пищевого продукта;

1000 пересчет на мг.

 

Результаты определений рассчитывают до третьей значащей цифры. За результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений.

Определение витамина Е. Для определения массовой доли витамина Е (суммы, α – β –, ᵞ –, ʸ –токоферолов) экстракт токоферолов после щелочного гидролиза вводят в детектор жидкостного хроматографа. Количественное определение проводят по интенсивности поглощения или флуоресценции.

Приготовление стандартного раствора α -токоферола. Для приготовления стандартного раствора взвешивают 0, 0400 г α -токоферола с точностью до 0, 0001 г, растворяют в этиловом спирте и доводят объем в мерной колбе до 100 см3. Срок годности данного раствора при температуре +4°0С 10 дней.

Приготовление рабочего стандартного раствора α -токоферола. В мерную колбу на 100 см3 переносят 5, 0 см3 раствора и доводят этиловым спиртом до метки. Срок годности данного раствора при температуре +4°0С 10 дней.

Приготовление рабочего стандартного раствора на основе α -токоферилацетата. При использовании в качестве стандарта α -токоферилацетата его подвергают щелочному гидролизу. Взвешивают 0, 0400 г α -токоферилацетата с точностью до 0, 0001 г, растворяют в этиловом спирте и доводят объем в мерной колбе до 100 см3. К 5 мл полученного раствора добавляют 15 см3 этилового спирта, 0, 1 г аскорбиновой кислоты, 1 см3 50 % раствора КОН, кипятят 15...20 мин на водяной бане с обратным водяным холодильником и экстрагируют.

После отгонки эфира остаток растворяют в 100 см3 абсолютного спирта (рабочий стандартный раствор). В день использования в рабочем стан­дартном растворе определяют концентрацию α -токоферола, измеряя оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 292 нм в 1 см:

,

где:

D – оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 292 нм, в кювете сравнения этиловый спирт;

1000 содержание α -токоферола в 1 мл 1 % раствора, мкг;

 

В рабочем стандартном растворе содержание α -токоферола должно быть около 20 мкг/мл.

Чистоту стандартного раствора проверяют спектрофотометрически (максимум при 292...294 нм) и хроматографически (на хроматограмме один пик, помимо пиков не удерживаемых на колонке примесей, содержащихся в растворителях).

Условия хроматографического анализа для метода обращенно-фазовой хроматографии:

Ø микроколоночный хроматограф «Милихром»,

Ø микроколонка (62x2 мм или 80x2 мм) с сорбентом «Силасорб» С18;

Ø объем пробы, вводимый на колонку, 10 мкл;

Ø подвижная фаза 98 % водный раствор метилового спирта или 95 % водный раствор ацетонитрила;

Ø скорость подачи подвижной фазы 100 мкл/мин. Определение α токоферола проводят с использованием ультрафиолетового (А = 292 нм) или флуориметрического детекторов. Время выхода α -токоферола должно находиться в пределах 9...15 мин. Для определения суммы Р, α -токоферолов необходимо наличие стандартных растворов этих форм.

Условия хроматографического анализа для метода нормально-фазовой хроматографии:

Ø микроколонки с силикагелем марки «Силасорб»;

Ø подвижная фаза гексан или гептан с небольшим содержанием изопропанола (1...1, 5 %) или метанола (0, 5...1 %),

Ø время выхода из колонки α -токоферола в пределах 3...5 мин.

При определении только токоферолов при наличии в экстракте ретинола необходимо проводить элюирование до выхода пика ретинола из колонки, иначе при повторном анализе он будет мешать при определении токоферола.

При совместном определении витамина А и Е детектирование следует проводить в двухволновом режиме (292 и 324 нм) детектирования. Кроме того, в условиях нормально-фазовой хроматографии разные формы витамина Е разделяются на отдельные пики, т.е. может быть получено четкое разделение 8 форм (4 токоферола и 4 токотриенола). В связи с этим необходимы стандартные растворы этих форм для их идентификации.

Проведение хроматографического анализа заключается в том, что в колонку жидкостного хроматографа вводят последовательно равные объемы испытуемого и стандартного растворов. Пик витамина на хроматограмме испытуемого раствора идентифицируют путем сравнения со временем удерживания пика витамина на хроматограмме стандартного раствора. Содержание витамина в образце определяют по результатам двух хроматографических анализов.

Расчет:

Содержание токоферола в образце в мг на 100 г продукта определяют по формуле:

,

где: D – оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 292 нм, в кювете сравнения этиловый спирт;

1000 содержание α -токоферола в 1 мл 1 % раствора, мкг;

Вычисления проводят до третьей значащей цифры. За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение (X) результатов двух параллельных определений.

Определение β -каротина следует проводить в условиях нормально фазовой ВЭЖХ на сорбентах типа «Силасорб», «Сепарон», «Нуклеосил» и других с размером частиц 5 мкм на микроколонках 62x2 или 80x2 мм. Подготовку образцов и стандартных растворов выполняют аналогично, как для витаминов А и Е.

Þ Подвижная фаза гексан или гептан с небольшим содержанием (0, 1 %) 2 пропанола.

Þ Оптимальный расход подвижной фазы составляет 100 мкл/мин,

Þ объем вводимой пробы 5 мкл,

Þ аналитическая длина волны 450 или 480 нм (детектор видимой области спектра), скорость движения диаграммы самописца 0, 3 см/мин. Если в наличии имеется только УФ детектор, в качестве аналитической применяют длину волны 290 нм.

В условиях стандартной ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектором, имеющим сменные фильтры, оптимальным является фильтр с длиной волны 436 нм. В этом случае можно использовать обращенно-фазовую ВЭЖХ на сорбенте «Силасорб» С18, 5... 10 мкм, размер колонки 250x3 мм, с элюентом состава метанол ацетонитрил хлороформ (47: 47: 6), расход элюента 1 мл/мин. Время анализа 15 мин.

Работа 2.2.3. Определение витаминов А и Е фотометрическим методом

Определение содержания ретинола-ацетата (витамина А) и токоферола-ацетата (витамина Е) ведут фотометрическим методом по ГОСТ Р 52147-2003 «Белково-витаминно-минеральные и амидо-витаминно-минеральные добавки». Сущность метода заключается в омылении образца водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов диэтиловым эфиром, разделении витаминов хроматографией на колонке с окисью алюминия и количественном определении витаминов фотометрическим методом.

Реактивы и материалы: Жировой продукт, витамин E, этиловый спирт, хлорное железо, калия гидроокись, натрий сернокислый, алюминия окись, эфир петролейный, эфир диэтиловый фармакопейный, пирогаллол, спирт этиловый, фенантролин, аскорбиновая кислота, фенолфталеин, вода дистиллированная.
Химическая посуда и оборудование: Весы, спектрофотометр, фотоэлектро-колориметр, холодильник, балон с азотом, испаритель, водяная баня, термометр, муфельная печь, секундомер, фарфоровые чашки, щипцы для тиглей, лампа ультрафиолетовая, шкаф сушильный, стеклянный холодильник, конические колбы, мерные колбы, делительные воронки, мерные цилиндры, воронки для фильтрования, пипетки с одной отметкой, пипетки градуированные, пробирки мерные с притертыми пробками, склянки из темного стекла, колбы с тубусом, колбы круглодонные, колбы стеклянные для хромотографии, экскикатор, фильтровальная бумага, вата обезжиренная, палочки деревянные.

Приготовление раствора хлорного железа массовой долей около 0, 2 % в абсолютированном спирте. Навеску реактива массой 0, 2 г растворяют в 99, 8 см3 абсолютированного этилового спирта. Раствор хранят в холодильнике в склянке из темного стекла не более 7 сут.

Приготовление раствора фенантролина или, дипиридила массовой долей около 0, 5 % в абсолютированном этиловом спирте. Навеску реактива массой 0, 500 г растворяют в 99, 5 см3 абсолютированного этилового спирта. Раствор хранят в холодильнике в склянке из темного стекла не более 7 сут.

Приготовление безводного сернокислого натрия. Реактив высушивают в сушильном шкафу при температуре (105 ± 2) 0С в течение 3 ч, хранят в склянке с притертой пробкой.

Приготовление окиси алюминия. Реактив прокаливают в муфельной печи при температуре (400 ± 10) 0С в течение 4 ч, охлаждают до комнатной температуры в эксикаторе. К 97 г реактива добавляют 3 см дистиллированной воды и тщательно перемешивают. После отстаивания в течение не менее 3 ч реактив годен к использованию. Реактив хранят в склянке с притертой пробкой.

Приготовление раствора α -токоферола массовой концентрации 1 мг/см3. Навеску токоферола-ацетата массой 0, 1120 г в расчете на содержание чистого вещества помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см3 добавляют от 100 до 200 мг аскорбиновой кислоты, 50 см3 этилового спирта и 10 см3 раствора гидроокиси калия массовой долей 50 %. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают в водяной бане при температуре (85 ± 2) 0С в течение 25 мин. Затем содержимое колбы быстро охлаждают под струей водопроводной воды до комнатной температуры, переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, приливают по 50 см3 дистиллированной воды и диэтилового эфира, встряхивают и отстаивают до разделения слоев. После расслаивания нижний водно-спиртовый слой сливают в коническую колбу, а эфирный слой оставляют в делительной воронке. В коническую колбу приливают 50 см3 диэтилового эфира, встряхивают, отстаивают и после расслаивания верхний эфирный слой присоединяют к эфирному экстракту в делительной воронке, а к водно-спиртовому слою в конической колбе снова приливают 50 см3 диэтилового эфира и проводят экстракцию, как было указано выше. После расслаивания эфирный слой из конической колбы снова присоединяют к экстракту в делительной воронке. Объединенные эфирные экстракты промывают дистиллированной водой порциями по 30 см3 до исчезновения розовой окраски промывных вод по реакции с фенолфталеином. Промытый экстракт переносят в коническую колбу вместимостью 250 см3, пропуская его через бумажный фильтр и слой безводного сернокислого натрия (10…15 г). После окончания фильтрации сернокислый натрий три раза промывают порциями (по 20…30см) диэтилового эфира. Эфир отгоняют в водяной бане при температуре не выше 50 0С в токе азота или под вакуумом, используя водоструйный насос или роторный испаритель. К сухому остатку приливают 10…15 см3 абсолютированного этилового спирта, количественно переносят раствор в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем в колбе до метки этим же спиртом и тщательно перемешивают.

Приготовление раствора α -токоферола массовой концентрации 20 мкг/см3. 1 см3 раствора α -токоферола массовой концентрации 1 мг/см3 переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят объем в колбе абсолютированным спиртом до метки и тщательно перемешивают. В полученном растворе проверяют массовую концентрацию α -токоферола и его чистоту, снимая спектр в пределах 260–310 нм на спектрофотометре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см относительно абсолютированного этилового спирта. Чистый α -токоферол имеет симметричный пик максимумом поглощения при длине волны 292 нм. Массовую концентрацию α -токоферола в растворе CE, мкг/см3, вычисляют по формуле:

,

где: D – оптическая плотность раствора при длине волны 292 нм;

106 – коэффициент пересчета граммов в микрограммы;

E1%1cм – оптическая плотность раствора α -токоферола в абсолютированном этиловом спирте массовой концентрации 1 г в 100 см3 при длине волны 292 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см.

Построение градуировочного графика для определения токоферола-ацетата (витамина Е). В пять мерных пробирок вместимостью по 5 см3 приливают 0, 5; 1, 0; 2, 0; 3, 0 и 4, 0 см3 раствора α -токоферола массовой концентрации 20 мкг/см3. В первые четыре пробирки добавляют 3, 5; 3, 0; 2, 0 и 1, 0 см3 абсолютированного этилового спирта. Затем в пробирки добавляют по 0, 5 см раствора ο -фенантролина и по 0, 5 см3 раствора хлорного железа, перемешивают. Ставят опытную пробу в темное место на 5 мин для развития окраски. По истечении времени измеряют оптические плотности испытуемых растворов в порядке возрастания их концентрации на фотоэлектроколориметре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм при длине волны (520 ± 25) нм относительно абсолютированного этилового спирта. Одновременно проводят контрольное испытание на реактивы без внесения α -токоферола. По полученным данным строят градуировочный график, откладывая на оси ординат значения разности оптической плотности испытуемых растворов и контрольного раствора, на оси абсцисс – содержание α -токоферола, мкг/5 см3(10, 20, 40, 60 и 80 мкг/5 см3).

Приготовление элюирующих растворов

Приготовление раствора I. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 6 см3 диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.

Приготовление раствора II. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 12 см3 диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.

Приготовление раствора III. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 30 см3 диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.







Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 1782. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Аальтернативная стоимость. Кривая производственных возможностей В экономике Буридании есть 100 ед. труда с производительностью 4 м ткани или 2 кг мяса...

Вычисление основной дактилоскопической формулы Вычислением основной дактоформулы обычно занимается следователь. Для этого все десять пальцев разбиваются на пять пар...

Расчетные и графические задания Равновесный объем - это объем, определяемый равенством спроса и предложения...

Кардиналистский и ординалистский подходы Кардиналистский (количественный подход) к анализу полезности основан на представлении о возможности измерения различных благ в условных единицах полезности...

Оценка качества Анализ документации. Имеющийся рецепт, паспорт письменного контроля и номер лекарственной формы соответствуют друг другу. Ингредиенты совместимы, расчеты сделаны верно, паспорт письменного контроля выписан верно. Правильность упаковки и оформления....

БИОХИМИЯ ТКАНЕЙ ЗУБА В составе зуба выделяют минерализованные и неминерализованные ткани...

Типология суицида. Феномен суицида (самоубийство или попытка самоубийства) чаще всего связывается с представлением о психологическом кризисе личности...

Деятельность сестер милосердия общин Красного Креста ярко проявилась в период Тритоны – интервалы, в которых содержится три тона. К тритонам относятся увеличенная кварта (ув.4) и уменьшенная квинта (ум.5). Их можно построить на ступенях натурального и гармонического мажора и минора.  ...

Понятие о синдроме нарушения бронхиальной проходимости и его клинические проявления Синдром нарушения бронхиальной проходимости (бронхообструктивный синдром) – это патологическое состояние...

Опухоли яичников в детском и подростковом возрасте Опухоли яичников занимают первое место в структуре опухолей половой системы у девочек и встречаются в возрасте 10 – 16 лет и в период полового созревания...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.01 сек.) русская версия | украинская версия