Определение активности глюкоамилазы

Цель работы: определение активности глюкоамилазы.

 

Оборудование, реактивы и материалы: аналитические и технические весы, фарфоровые ступки, термостат, водяная баня, фотоэлектроколориметр, воронки с бумажными фильтрами, центрифуга, пипетки мерные и градуированные вместимостью 1, 5, 10 см³, колбы Эрленмейера вместимостью 50 и 250 см³, мерная колба вместимостью 100 см³, пробирки, мерный цилиндр вместимостью 100 см³; раствор растворимого крахмала с массовой долей 2 %, ацетатный буферный раствор с pH 4, 7 (57, 25 см³ ледяной уксусной кислоты растворяют в 1 дм³ раствора, 82 г безводного ацетата натрия растворяют в 1 дм³ раствора, 50 см³ раствора уксусной кислоты смешивают с 50 см³ раствора ацетата натрия), трисбуфер с pH 7, 0 (61 г трисоксиметиламинометана растворяют в 85 см³ раствора соляной кислоты с концентрацией 5 моль/дм³, объем доводят до 1 дм³ дистиллированной воды и перемешивают). Величину pH буфера доводят до нужного значения соляной кислотой), глюкозооксидазный реактив (растворы глюкозооксидазы, пероксидазы и о-дианизидина смешивают в соотношении 1: 1: 1), стандартный раствор глюкозы (10-60 мкг глюкозы растворяют в 1 см³ дистиллированной воды); раствор фермента поверхностной культуры грибов (навеску тщательно измельченной поверхностной культуры гриба массой 5 г растворяют в 10 см³ ацетатного буферного раствора и 90 см³ дистиллированной воды, термостатируют при температуре 30 °С, периодически перемешивая, и фильтруют через складчатый фильтр, полученный экстракт используют в качестве основного раствора), раствор очищенного ферментного препарата (массу навески препарата 0, 1 г взвешивают на аналитических весах и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, приливают небольшое количество дистиллированной воды и перемешивают в течение 15 мин до полного растворения ферментного препарата, доводят содержимое колбы до метки дистиллированной водой); рабочий раствор фермента (10 см³ раствора фермента поверхностной культуры гриба или раствора очищенного ферментного препарата переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доливают до метки дистиллированной водой. При необходимости полученный раствор разбавляют вторично так, чтобы в 5 см³ рабочего раствора содержалось то количество фермента, которое при гидролизе крахмала привело бы к образованию не более 60 мкг глюкозы в 1 см³ гидролизата. Аналогично готовят пробу из культуральной жидкости микроорганизмов).

 

Теоретические сведения

Глюкоамилазы (ГлА) расщепляют в амилозе и амилопектине (отдельных компонентах крахмала) a-1, 4, a-1, 6 – гликозидные связи.

Метод определения активности основан на количественном определении глюкозы, образующейся при гидролизе растворимого крахмала ферментом глюкоамилазой. Глюкоамилазная активность ГлА характеризует способность ферментного препарата катализировать расщепление растворимого крахмала до глюкозы и выражается числом единиц активности в 1 г препарата. За единицу глюкоамилазной активности принято такое количество фермента, которое, гидролизуя растворимый крахмал при температуре 30 °С и рН 4, 7 в течение 1 мин, освобождает 1 мкмоль глюкозы.

Фермент глюкозооксидаза катализирует окисление d-глюкозы кислородом воздуха до глюконовой кислоты. Вторым продуктом реакции является пероксид водорода. Оба конечных продукта образуются в количествах, эквимолярных окисленной глюкозе. Присутствующая в растворе пероксидаза катализирует окисление о-дианизидина пероксидом водорода и образуется окрашенное соединение.

Определяя на ФЭКе интенсивность окраски, пропорциональную количеству образовавшейся глюкозы, устанавливают количество глюкозы в растворе.

Ход работы

Построение градуировочного графика. Для каждой серии определений строят градуировочный график по данным оптических плотностей, полученных при анализе стандартных растворов глюкозы. Стандартные растворы готовят с содержанием сахара 10-60 мкг в 1 см³ и проводят с ними ферментативную реакцию в рассмотренных условиях с глюкозооксидазным реактивом. При определении активности бражки готовят основной раствор из 100 мг глюкозы на 100 см³ воды. Из основного раствора делают ряд разведений:

10 мкг глюкозы: 0, 5 см³ – 50 см³ H₂O – раствор 1;

30 мкг глюкозы: 1, 5 см³ – 50 см³ H₂O – раствор 2;

40 мкг глюкозы: 2, 0 см³ – 50 см³ H₂O – раствор 3;

50 мкг глюкозы: 2, 5 см³ – 50 см³ H₂O – раствор 4;

60 мкг глюкозы: 3, 0 см³ – 50 см³ H₂O – раствор 5.

Из стандартных растворов глюкозы (1-5) берут по 1 см³ в колбы на 50 см³ и вносят 2, 5 см³ глюкозооксидазного раствора на основе о-дианизидина.

В результате получают ряд значений оптических плотностей, соответствующих определенному содержанию глюкозы в 1 см³. По оси абсцисс откладывают содержание глюкозы в 1 см³ раствора, а по оси ординат – оптическую плотность. Строят прямую, по которой, установив оптическую плотность исследуемого раствора, определяют количество образовавшейся глюкозы в реакционной среде (рисунок).

 

 

Рисунок. Зависимость оптической плотности растворов

 

Определение активности глюкоамилазы. В пробирку наливают 10 см³ раствора с массовой долей крахмала 1 % и помещают в водяную баню с температурой 30 °С на 5-10 мин. Приливают 5, 0 см³ исследуемого ферментного раствора глюкоамилазы, перемешивают и выдерживают при температуре 30 °С в течение 10 мин. По истечении этого времени от гидролизата отбирают 1 см³, переносят в маленькую пробирку с притертой пробкой и помещают в водяную баню при температуре кипения на 10 мин. Затем содержимое пробирки быстро охлаждают.

Одновременно с исследуемой пробой готовят контроль на крахмал и фермент. Для этого 5 см³ ферментного раствора помещают в пробирку и инактивируют его в течение 10 мин в водяной бане при температуре кипения. Затем раствор охлаждают и добавляют к нему 10 см³ раствора крахмала. С полученным раствором производят все последующие операции, как и с опытным.

В опытном и контрольном растворах определяют глюкозу. Для этого в пробирки с охлажденными гидролизатами вносят по 2, 5 см³ глюкозооксидазного реактива (содержит растворы ферментов глюкозооксидазы и пероксидазы и раствор о-дианизидина в соотношении 1: 1: 1), перемешивают и помещают в водяную баню с температурой 37 °С на 30 мин.

После реакции в опытном и контрольном растворах развивается окраска, интенсивность которой определяют на ФЭКе (l = 455 нм, кювета с шириной грани 5 мм) против контроля на реактивы (2, 5 см³ глюкозооксидазного реактива смешивают с 1 см³ дистиллированной воды).

Установив оптическую плотность растворов по градуировочному графику функции D = f(c), где D – оптическая плотность, с – концентрация глюкозы, мкг/см³, рассчитывают количество образовавшейся глюкозы в реакционной среде.

Расчет активности глюкоамилазы глюкоамилазы ГлА, ед/г или ед/см³, ведут по формуле

 

,

 

где a – прирост глюкозы, образовавшейся в 1 см³ гидролизата

за счет действия фермента, мкг;

b – масса фермента в 1 см³ гидролизата, г или см³;

180 – относительная молекулярная масса глюкозы;

10 – время гидролиза, мин.

 

Пример расчета. 100 мг ферментного препарата растворили в колбе вместимостью 100 см³ и довели объем до метки дистиллированной водой. Затем 15 см³ приготовленного раствора внесли в мерную колбу вместимостью 100 см³ и довели объем до метки дистиллированной водой. На определение взяли 5 см³ исследуемого раствора. Объем реакционной смеси 15 см³. В соответствии с разведением количество фермента в гидролизате b = 0, 1× 15× 5, 0/(100× 100× 15) = 0, 00005 г.

В результате колориметрирования этого раствора получена величина оптической плотности D = 0, 173. По градуировочному графику эта величина соответствует 87 мкг глюкозы. Подставляя ее в формулу, определяем значение глюкоамилазной активности

_ед/г

 

Контрольные вопросы и задания

1. Какие связи в молекуле крахмала гидролизует глюкоамилаза?

2. Суть метода определения активности глюкоамилазы.

3. Сколько глюкозы образуется при гидролизе 10 г крахмала глюкоамилазой?

Лабораторная работа № 23