Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Влияние температуры и pH на активность a-амилазы





Цель работы: изучение некоторых свойств фермента a-амилазы.

Оборудование, реактивы и материалы: аналитические и технические весы, термостаты, термометр, центрифуга, стеклянная воронка, бумажные фильтры, мерные колбы на 100 см3, пробирки, на 1, 2, 10 и 20 см3, бюретка, пробирка с эталоном (стандартным образцом декстринов с йодом), закрепленная на бумажном экране, с обратной стороны которого помещается электрическая лампочка; раствор уксусной кислоты с концентрацией 1 моль/дм3 (60 г ледяной уксусной кислоты растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды), кварцевый песок, раствор ацетата натрия с концентрацией 1 моль/дм3 (136 г водного ацетата натрия растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды), раствор КН2РО4 с концентрацией 1 моль/дм3 (9, 078 г КН2РО4 растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды), раствор Na2HPO4 с концентрацией 1 моль/дм3 (11, 876 г Na2HPO4 · 12 Н2О растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды), основной йодный раствор (11 г кристаллического йода растирают с 22 г йодита калия, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 500 см3 и доливают до метки дистиллированной водой), рабочий йодный раствор (8 см3 основного йодного раствора, 80 г йодита калия вносят в мерную колбу на 2 дм3, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки), стандартный образец (25 г CoCl2 и 3, 84 K2CrO7 растворяют в 100 см3 раствора соляной кислоты с концентрацией 0, 01 моль/дм3), раствор крахмала с массовой долей 2 % (20 г крахмала растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, кипятят оставшуюся воду и осторожно, так, чтобы не прекращалось кипение вливают растворенный крахмал в кипящую воду. Объем дистиллированной воды 980 см3); солодовая вытяжка (к 4 г тонкоизмельченного солода прибавляют 100 см3 дистиллированной воды и экстрагируют в течение 1 ч при 30 0С, полученную суспензию фильтруют через складчатый фильтр или центрифугируют. Прозрачный фильтрат используют как источник a-амилазы), раствор ферментного препарата (0, 1 г ферментного препарата растворяют в 100 см3 дистиллированной воды).

Теоретические сведения

 

Амилазы - ферменты, гидролизующие крахмал, широко применяются в спиртовой промышленности для осахаривания крахмалистого сырья, в хлебопечении для увеличения в тесте сбраживаемых сахаров.

Фермент a-амилаза относится к классу гидролаз, подклассу гликозидаз. Содержится в организме животных и человека (в слюне, соке поджелудочной железы), плесневых грибах и других микроорганизмах, солоде (проросшем зерне) пшеницы, ячменя, ржи, проса.

a-Амилаза гидролизует в крахмале и родственных полисахаридах глубинные a-1-4-гликозидные связи без определенного порядка. При этом образуются декстрины и небольшое количество мальтозы, поэтому a-амилазу называют ферментом декстринирующего действия.

Метод определения активности a-амилазы основан на качественной реакции продуктов гидролиза – декстринов с раствором йода (в результате гидролиза интенсивная синяя окраска крахмала с йодом переходит в винно-красную).

 

Ход работы

 

В колбу на 100 см3 вносят пипеткой 20 см3 раствора крахмала и 8 см3 буферных растворов для создания определенного значения рН. Объем буферных растворов для разных значений рН представлен в таблице. Затем буферную смесь и крахмал помещают на водяную баню и прогревают при заданной температуре (20 и 50 °С) в течение 5-8 мин. Затем в колбу (не вынимая из бани) добавляют 2 см3 солодовой вытяжки или раствора фермента и перемешивают. Записывают время внесения фермента (начало гидролиза).

 

Растворы, см3 рН среды
4, 0 5, 0 6, 0 7, 0 8, 0
СНЗСООН 6, 9 2, 7 0, 4
СНЗСООNа 1, 1 5, 3 7, 6
NаН2РO4.12Н2О 4, 8 7, 6
КН2РO4 3, 2 0, 4

 

Через определенные промежутки времени отбирают по 1 см3 гидролизной смеси, вносят ее в пробирку с 5 см3 рабочего йодного раствора, встряхивают, сравнивают с эталоном. Сопоставлять окраску удобно на фоне экрана, освещенного с обратной стороны электрической лампой. Когда очередная проба гидролизата с рабочим йодным раствором дает окраску, идентичную с эталоном, гидролиз заканчивается. Записывают время его окончания.

Декстринирующая активность А, ед/г, определяется по формуле

,

 

где 0, 4 – навеска крахмала в 20 см3 раствора с массовой долей 2 %;

60 – пересчет минут в часы;

V – объем раствора фермента или экстракта, взятый для

гидролиза, см3;

t – время декстринизации, мин;

n – содержание фермента или солода в 1 см3 раствора или

экстракта, г.

 

Пример расчета. Для экстракции фермента была взята навеска солода массой 4 г, добавлено 100 см3 дистиллированной воды. Это соответствует содержанию солода в 1 см3 экстракта 0, 04 г. Объем экстракта для гидролиза крахмала составил 2 см3. Время окончания гидролиза - 20 мин. Следовательно, декстринирующая активность солода равна

 

ед/г

 

Оформление результатов

Полученные данные вносят в таблицу, активность фермента выражают в процентах от максимальной.

 

Температура, °С Показатели рН
4, 0 5, 0 6, 0 7, 0 8, 0
  Время декстринизации, мин Активность, ед/г Активность, %  
  Время декстринизации, мин Активность, ед/г Активность, %  

 

На основании данных таблицы строят график зависимости А = f(рН) для всех исследуемых температур и определяют оптимальные режимы работы a-амилазы солода.

 

Контрольные вопросы и задания

 

1. Что является субстратом для a-амилазы и какие связи в молекуле субстрата она гидролизует?

2. Что такое декстрины? Как определить декстринирующую активность солода?

3. В чем суть метода определения активности a-амилазы?

4. Какое значение имеет a-амилаза в технологии хлебопечения, пивоварении, спиртовом производстве?

5. 2, 0 мг a-амилазы, за 10 мин при температуре 38 °С и рН 6, 0 катализировал образование 40 мкМ декстринов. Рассчитайте удельную активность амилазы. Объясните, как и почему изменится (уменьшится, увеличится) активность фермента, если инкубационную среду подкислить до рН 4, 0 и температуру среды повысить до 75 °С.

 

Лабораторная работа № 21







Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 2425. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!




Обзор компонентов Multisim Компоненты – это основа любой схемы, это все элементы, из которых она состоит. Multisim оперирует с двумя категориями...


Композиция из абстрактных геометрических фигур Данная композиция состоит из линий, штриховки, абстрактных геометрических форм...


Важнейшие способы обработки и анализа рядов динамики Не во всех случаях эмпирические данные рядов динамики позволяют определить тенденцию изменения явления во времени...


ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ МЕХАНИКА Статика является частью теоретической механики, изучающей условия, при ко­торых тело находится под действием заданной системы сил...

Дренирование желчных протоков Показаниями к дренированию желчных протоков являются декомпрессия на фоне внутрипротоковой гипертензии, интраоперационная холангиография, контроль за динамикой восстановления пассажа желчи в 12-перстную кишку...

Деятельность сестер милосердия общин Красного Креста ярко проявилась в период Тритоны – интервалы, в которых содержится три тона. К тритонам относятся увеличенная кварта (ув.4) и уменьшенная квинта (ум.5). Их можно построить на ступенях натурального и гармонического мажора и минора.  ...

Понятие о синдроме нарушения бронхиальной проходимости и его клинические проявления Синдром нарушения бронхиальной проходимости (бронхообструктивный синдром) – это патологическое состояние...

Случайной величины Плотностью распределения вероятностей непрерывной случайной величины Х называют функцию f(x) – первую производную от функции распределения F(x): Понятие плотность распределения вероятностей случайной величины Х для дискретной величины неприменима...

Схема рефлекторной дуги условного слюноотделительного рефлекса При неоднократном сочетании действия предупреждающего сигнала и безусловного пищевого раздражителя формируются...

Уравнение волны. Уравнение плоской гармонической волны. Волновое уравнение. Уравнение сферической волны Уравнением упругой волны называют функцию , которая определяет смещение любой частицы среды с координатами относительно своего положения равновесия в произвольный момент времени t...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2025 год . (0.009 сек.) русская версия | украинская версия