Ход работы. В коническую колбу вместимостью 50 см3 (или пробирку диаметром 2 см и высотой 18 см) приливают 20 см3 раствора крахмала с массовой долей 2 % и буферную смесь

 

В коническую колбу вместимостью 50 см³ (или пробирку диаметром 2 см и высотой 18 см) приливают 20 см³ раствора крахмала с массовой долей 2 % и буферную смесь для создания определенного рН при соотношении компонентов, указанных в таблице (см. лабораторную работу № 20).

Полученные растворы прогревают до заданной температуры (20 и 50 °С) путем погружения сосудов со смесью в термостат и выдерживают в течение 10 мин. Не вынимая сосуда из термостата, приливают 2 см³ ферментной вытяжки солода (при этом объем смеси в каждой пробе станет равным 30 см³) и ведут реакцию в течение 15 мин. Затем реакцию останавливают, приливая 20 см³ раствора Н₂SО₄ с массовой долей 1 %, быстро и энергично перемешивая реакционную смесь.

Для количественного определения образовавшейся в результате гидролиза мальтозы отбирают 5 см³ полученной смеси и помещают в колбу вместимостью 50 см³, содержащую 10 см³ раствора К₃Fе(СN)₆ с концентрацией 0, 1 моль/дм³.

После перемешивания содержимого колбу погружают в водяную баню с температурой кипения воды (уровень смеси должен быть на 3-4 см ниже уровня воды в бане) и выдерживают 20 мин. Затем смесь охлаждают под струей проточной воды, приливают 25 см³ уксусного реактива и все тщательно перемешивают. К смеси добавляют 1 см³ комбинированного раствора крахмала с КJ и снова перемешивают. Полученную смесь титруют раствором гипосульфата натрия Na₂S₂O₃ с массовой долей 0, 1 моль/дм³ до полного исчезновения синего цвета.

Объем, пошедший на титрование, фиксируют и вычитают из 10. Таким образом определяют объем (см³) раствора K₃Fе(СN)₆, с массовой долей 0, 1 моль/дм³, пошедшего на окисление мальтозы. В таблице представлено соотношение между содержанием мальтозы и количеством K₃Fe(CH)₆, пошедшим на окисление мальтозы. По полученным результатам в соответствии с данными таблицы определяют массу мальтозы в 5 см³ гидролизованной смеси общим объемом 50 см³ (30 см³ гидролизата плюс 20 см³ раствора Н₂sО₄ с массовой долей 1 %).

 

Объем КЗFе(СN)6, см3	Масса мальтозы, мг	Объем КЗFе(СN)6, см3	Масса мальтозы, мг
0, 5 1, 0 1, 5 2, 0 2, 5 3, 0 3, 5 4, 0 4, 5 5, 0	1, 46 2, 96 4, 33 5, 85 7, 32 8, 79 10, 28 11, 83 13, 40 14, 79	5, 5 6, 0 6, 5 7, 0 7, 5 8, 0 8, 5 9, 0 9, 5	16, 57 18, 20 19, 85 21, 50 23, 15 24, 88 25, 70 28, 63 30, 65

 

Рассчитывают осахаривающую активность солода по формуле

 

 

где А – осахаривающая активность солода, г/(г × ч);

m – масса мальтозы в 5 см³ смеси, мг;

10 – коэффициент пересчета на общий объем гидролизо-

ванной смеси;

60 – пересчет минут в часы;

0, 02 – навеска солода в 1 см³ вытяжки, г;

0, 95 – коэффициент пересчета мальтозы на крахмал;

15 – время гидролиза, мин;

1000 – коэффициент перевода единицы измерения массы

из мг в г;

2 – объем солодовой вытяжки, см³.

 

Осахаривающую активность определяют числом граммов растворимого крахмала, который превращает в мальтозу 1 г солода в течение 1 ч.

 

Пример расчета. Количество раствора К₂Fе(СN)₆ с концентрацией 0, 1 моль/дм³, пошедшего на окисление мальтозы, содержащейся в 5 см³ гидролизата, было 4, 5. По таблице это соответствует 13, 40 мг мальтозы. Конечный объем реакционной жидкости 50 см³ (30 см³ гидролизата плюс 20 см³ раствора серной кислоты). Следовательно, мальтозы в гидролизате было 13, 40 · 10 = 134, 0 мг.

Осахаривающая активность солода

 

г/(г × ч).

 

Оформление результатов

Расчетные данные вносят в таблицу результатов и выражают активность фермента в процентах от максимальной.

 

Температура, оС	Определяемая величина	рН среды
4, 0	5, 0	6, 0	7, 0	8, 0
	Масса мальтозы, мг Активность, г /(г·ч) Активность, %
	Масса мальтозы, мг Активность, г/(г·ч) Активность, %

 

На основании расчетных данных строят график зависимости А = f(рН) для всех исследуемых температур и определяют оптимальные режимы работы фермента b-амилазы солода.

 

Контрольные вопросы и задания

1. Почему b-амилазу называют осахаривающим ферментом?

2. Что является субстратом для b-амилазы и какие связи в субстрате она гидролизует?

3. Как определить активность b-амилазы?

4. Значение b-амилазы в технологии хлебопечения, спиртовом производстве.

Лабораторная работа № 22