При различных температурах

 

Цель работы: изучение влияния температуры на активность b-фруктофуранозидазы и определение условия наиболее интенсивного гидролиза субстрата.

Оборудование, реактивы и материалы: аналитические и технические весы, центрифуга, электроплита, термостат, водяная баня, термометр, фарфоровая ступка с пестиком, кварцевый песок, колба Бунзена с асбестовым фильтром Шотта, насос Комовского, мерные колбы вместимостью 50 и 100 см³, колбы Эрленмейера вместимостью 250 см³, пипетки вместимостью 2, 5, 10 см³, стеклянные воронки с бумажными фильтрами, мерные цилиндры вместимостью 50 и 100 см³, бюретка; раствор гидроксида натрия с концентрацией 0, 1 моль/дм³, раствор железоаммонийных квасцов (120 г железоаммонийных квасцов растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды и добавляют 100 см³ концентрированной серной кислоты или 50 г сульфата железа (III) растворяют в 800 см³ дистиллированной воды и добавляют 200 см³ концентрированной серной кислоты), раствор Фелинга I (40 г сульфата меди вносят в мерную колбу вместимостью 1 дм³, растворяют в 600 см³ горячей дистиллированной воды, охлаждают, доводят объем до метки, перемешивают и фильтруют), раствор Фелинга II (200 г тартрата калия-натрия и 150 г гидроксида натрия помещают в фарфоровый стакан, наливают в него 500 см³ дистиллированной воды и перемешивают стеклянной палочкой до полного растворения. Раствор охлаждают, переводят в мерную колбу на 1 дм³, доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и фильтруют через стеклянный фильтр), раствор перманганата калия концентрацией 0, 1 моль/дм³. Раствор сахарозы с массовой долей 5 %; раствор спиртоосажденного препарата фермента (1–2 г препарата помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют дистиллированной воды до метки, термостатируют при 30-35 °С до полного растворения), ферментная вытяжка культур дрожжей или микромицетов (20 г прессованных дрожжей или культуры микромицетов тщательно растирают с кварцевым песком, доливают 50 см³ дистиллированной воды, выдерживают в термостате с температурой 30 °С в течение 1 ч, вновь растирают всю массу, затем центрифугируют или фильтруют через бумажный фильтр).

Теоретические сведения

b-фруктофуранозидаза специфически расщепляет сахарозу до свободной глюкозы и фруктозы, смесь которых называют инвертным сахаром, и содержится в активной форме в дрожжах, микромицетах и в растениях. В свеклосахарном производстве b-фруктофуранозидаза оказывает отрицательное действие, вызывая потери основного продукта. Ее применение для гидролиза сахарозы в пищевой технологии позволит улучшить качество продуктов, сократить расходы сахара.

Образующийся под действием этого фермента инвертный сахар препятствует кристаллизации сахарозы в кондитерских изделиях. Как правило, b-фруктофуранозидаза, содержащаяся в дрожжах, обладает высокой активностью. Дрожжи с низкой ферментативной активностью малопригодны для хлебопекарного и бродильного производств.

Гидролиз сахарозы происходит по следующей схеме:

 

 

Метод определения активности b-фруктофуранозидазы основан на количественном учете суммы редуцирующих сахаров (инвертного сахара), полученной при гидролизе. Субстрат сахароза не редуцирующий сахар, поэтому интенсивность наращивания редуцирующих веществ в смеси характеризует активность фермента b-фруктофуранозидазы. Количество образовавшихся редуцирующих сахаров определяют методом Бертрана.

Метод основан на способности редуцирующих сахаров, обладающих свободной карбонильной группой (глюкоза, фруктоза), восстанавливать в щелочной среде оксид меди (II). Образующийся при этом оксид меди (I) может быть учтен объемным методом.

При смешивании сульфат меди сначала реагирует с гидроксидом натрия, образуя голубой осадок гидроксида меди:

 

СuSO₄ + 2NаОН Cu(ОН)₂ + Nа₂SО₄,

 

который, реагируя с тартратом, дает синий раствор фелинговой жидкости:

 

ОН НО–CH–СООNа O–СН–СООNа

Сu + Сu + 2Н₂О

ОН НО–СН–СООК O–СН–СООК

 

В фелинговой жидкости медь находится в виде комплексной соли, которая растворима в воде, и медь уже не выпадает в осадок. Комплексный ион при кипячении реагирует с карбонильной группой сахаров. При этом освобождается оксид меди (II), который в момент выделения, отдавая кислород на окисление сахаров, восствнавливается, превращаясь в нерастворимый в воде гемиоксид меди Сu₂О красного цвета:

 

O

С

H O–CH–СООNа

(СНОН)₄ + 2 Сu + 2Н₂О

O–СН–СООК

СН₂ОН

 

СООН

НО–СН–СООNа

Сu₂О¯ + (СНОН)₄ + 2

НО–СН–СООК

СН₂ОН

 

Как видно из схемы, количество образовавшегося осадка оксида меди (I) строго соответствует количеству редуцирующего сахара.

Для количественного учета осадка оксид меди (I) переводят в более устойчивый оксид меди (II) под действием раствора сульфата оксида железа (III) в присутствии серной кислоты. При этом оксид железа (III) восстанавливается:

 

Сu₂О + Fe₂(SO₄)₃ + Н₂SO₄ 2СuSO₄ + 2FeSO₄ + Н₂О.

 

Затем количество восстановленного железа определяют титрованием раствора перманганатом калия:

10FеSO₄ + 2КМnO₄ + 8Н₂SO₄ 5Fе₂(SO₄)₃ + 2МnSO₄ + К₂SO₄ +8Н₂О.

 

Титр перманганата калия устанавливают по щавелевой кислоте или по меди – 1 см³ 0, 1 моль/дм³ раствора КМnO₄ соответствует 6, 36 мг Сu.

 

 

Ход работы

В колбу вместимостью 50 см³ (или пробирку 2´ 18 см) приливают 5 см³ раствора сахарозы с массовой долей 5 % и прогревают на водяной бане до заданной температуры (5-8 мин). Затем приливают 2 см³ раствора фермента, перемешивают содержимое колбы и ведут гидролиз в течение 30 мин. Для остановки реакции в смесь добавляют 5 см³ раствора гидроксида натрия с концентрацией 0, 1 моль/дм³, содержимое количественно переносят в мерную колбу на 100 см³. Объем в колбе доводят до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивая содержимое. В полученном растворе гидролизата определяют количество редуцирующих сахаров методом Бертрана.

Для определения редуцирующих сахаров в исследуемых пробах отбирают из каждой колбы 20 см³ полученных смесей и переносят в соответствующие конические колбы вместимостью 200-250 см³. Затем в каждую из них вносят по 20 см³ растворов Фелинга I и II (при этом используют мерный цилиндр). Содержимое перемешивают и кипятят на электроплитке в течение 3 мин. Затем добавляют 30 – 40 см³ холодной дистиллированной воды и настаивают 3–5 мин для образования красного осадка оксида меди (I). Содержимое колб фильтруют через асбестовый фильтр, пользуясь насосом Комовского. После отделения надосадочной жидкости осадок дважды отмывают горячей дистиллированной водой от остатков щелочи декантацией в колбе, а затем – на фильтре. Промывные воды из колбы Бунзена выливают, тщательно моют и ополаскивают дистиллированной водой. Промытый осадок в колбе растворяют, внося 10-15 см³ раствора железоаммонийных квасцов. Красный осадок Сu₂О на фильтре растворяют аналогично, полученные растворы объединяют (перенос жидкостей необходимо осуществлять количественно) и титруют 0, 1 моль/дм³ раствором КМnO₄ из бюретки до появления розового не исчезающего в течение 30 с цвета. Объем, пошедший на титрование, фиксируют, затем умножают на 6, 36 (число мг меди, соответствующее 1 см³ 0, 1 моль/дм³ раствора КМnO₄) и находят количество инвертного сахара по таблице, где представлено соотношение между содержанием сахаров в растворе и массой восстановленной меди. Опыт повторяют при температуре 20, 30, 40, 50, 60 ^оС.

 

Пример расчета. Объем 0, 1 моль/дм³ раствора КМnО₄, пошедшего на титрование, было 2 см³. Умножив результат на 6, 36, получают число мг оксида меди, которое образовалось в результате реакции. Это число равно 31, 8 мг. По таблице это соответствует 15, 75 мг инвертного сахара.

 

Оформление результатов

Все полученные экспериментальные и расчетные данные оформляют в виде таблицы.

 

Показатели	Температура, оС
Объем КМnO4, пошедший на титрование, см3 Масса меди, мг Содержание инвертного сахара: мг %

 

По данным таблицы строят график зависимости А = f(t) и определяют температуру наиболее интенсивного гидролиза сахарозы.

Медь, мг	Ин- вертный сахар, мг	Медь, мг	Ин- вертный сахар, мг	Медь, мг	Ин- вертный сахар, мг	Медь, мг	Ин- вертный сахар, мг
	9, 7 10, 20 10, 70 11, 20 11, 70 12, 21 12, 73 13, 25 13, 75 14, 25 14, 75 15, 25 15, 75 16, 25 16, 75 17, 25 17, 79 18, 42 18, 80 19, 30 19, 80 20, 30 20, 80 21, 36 21, 86 22, 43 22, 95 23, 50 24, 00 24, 50 25, 10		25, 63 26, 16 26, 68 27, 32 27, 74 28, 36 28, 78 29, 31 29, 34 30, 94 30, 94 31, 48 32, 00 32, 55 33, 10 33, 63 34, 17 34, 72 35, 30 35, 80 36, 41 36, 89 37, 44 38, 00 38, 53 39, 05 39, б1 40, 17 40, 70 41, 38 41, 88	10б	42, 44 43, 00 43, 55 44, 10 45, 20 45, 80 46, 80 46, 99 47, 97 48, 05 48, 95 49, 22 49, 78 50, 25 50, 94 51, 35 52, 12 52, 67 52, 67 53, 23 53, 80 54, 47 55, 00 55, 59 56, 19 56, 70 57, 30 57, 90		60, 23 60, 82 61, 44 62, 05 62, 65 63, 25 63, 67 64, 47 65, 07 65, 66 66, 25 66, 67 67, 47 68, 07 68, 35 69, 29 69, 88 70, 50 71, 12 71, 87 72, 37 73, 00 73, 62 74, 25 74, 88 75, 50 76, 06 76, 68

 

Контрольные вопросы и задания

1. Приведите структурную формулу сахарозы и покажите, какие связи в молекуле сахарозы гидролизует b-фрукто-фуранозидаза.

2. Что такое инвертный сахар?

3. Какие сахара относятся к редуцирующим? В чем суть метода определения редуцирующих сахаров?

4. На титрование редуцирующих сахаров по методу Бертрана израсходовано 5, 6 см³ раствора перманганата калия с массовой долей 0, 1 моль/дм³. Вычислите массу восстановленной меди в мг и по таблице (с. 99) определите содержание инвертного сахара в исследуемой пробе.