Ферментативной реакции

Цель работы: определение константы Михаэлиса К_m и максимальной скорости гидролиза казеина трипсином методом двойных обратных величин, а также расчет оптимальной концентрации субстрата.

 

Оборудование, реактивы и материалы: водяной термостат, пробирки, пипетки; воронки; складчатые фильтры; казеина с массовой долей 7, 5 %; 5 %; 2, 5 %; 1, 25 %; 0, 63 %, раствор трипсина, трихлоруксусная кислота с массовой долей 5 %, гидроокись натрия с концентрацией 0, 5 моль/дм³, реактив Фолина, реактив А, реактив Б, виннокислый натрий с массовой долей 2 %, сернокислая медь с массовой долей 1 %.

 

Теоретические сведения

 

Метод Лайнуивера-Бэрка (метод двойных обратных величин) является одним из наиболее простых и удобных для эксперементального определения К_m и максимальной скорости реакции V _max.

Значение К_m и V _max находят путем анализа кинетических данных. По Лайнуиверу-Берку, для этих целей широко используется зависимость 1/ v от 1 /[S] – метод двойных обратных величин. Уравнение Михаэлиса – Ментен принимает в этом случае следующий вид

 

 

где К_m – константа Михаэлиса;

V _max – максимальная скорость ферментативной реакции;

[S] – концентрация субстрата;

V – начальная скорость ферментативной реакции.

Это уравнение прямой: у = ах + b, где а = К_m / V _max – тангенс угла наклона прямой, b = 1 /V _max, y = 1 /v, x = 1 /[S].

Для определение значений К_m и V _max рассчитывают начальную скорость ферментативной реакции (активность фермента) при разных концентрациях субстрата. Полученные данные изображают графически, откладывая на оси ординат величину 1/ V, а по оси абсцисс 1 /[S]. Тангенс угла наклона прямой равен К_m/V _max, а длина отрезка, отсекаемого на оси ординат равна 1/ V _max. Для определения К_m и V _max расщепления казеина трипсином необходимо определить удельную активность трипсина (V _уд) при разных концентрациях субстрата. Количественное определение удельной активности трипсина проводят по методу Ансона. Принцип метода состоит в том, что по мере ферментативного расщепления белков протеолитическими ферментами в сфере реакции накапливаются аминокислоты, в том числе тирозин. После осаждения неразложившихся белков определяют содержание тирозина методом Лоури (см. лабораторную работу № 12).

Ход работы

 

В пять пробирок наливают по 3 см³ казеина (субстрата) с разной массовой долей и приливают в них по 3 см³ раствора трипсина.

Для контрольного определения в другие пробирки отбирают по 3 см³ полученной смеси и добавляют по 3 см³ раствора трихлоруксусной кислоты с массовой долей 5 %, вызывая таким образом денатурацию фермента. Через 10 мин отфильтровывают содержимое пробирок через складчатый фильтр.

Для опытного определения смесь 40 мин выдерживают в водяном термостате при 37 ^оС. По истечении этого времени к опытной пробе добавляют 3 см³ раствора трихлоруксусной кислоты с массовой долей 5 % и через 10 мин отфильтровывают.

Из контрольного и опытного фильтратов отбирают в пробирки по 2 см³ смеси и приливают по 4 см³ гидроксида натрия с концентрацией 0, 5 моль/дм³, по 1 см³ реактива Фолина и через 10 мин колориметрируют на фотоэлектроколориметре при 670 нм в кювете 5 мм. По калибровочной кривой находят количество тирозина в мкг, образующего при расщеплении казеина трипсином.

Расчет удельной активности V _уд, мг тирозина/мг белка производят с учетом разведений по следующей формуле:

 

где а – количество тирозина, найденное по калибровоч-

ной кривой;

b – количество белка, мкг.

 

Удельную активность трипсина рассчитывают для всех пяти проб, отличающихся различной концентрацией субстрата, и строят график Лайнуивера-Бэрка (рисунок).

 

Рисунок. График Лайнуивера-Берка

Для этого на оси абсцисс откладываются величины, обратные концентрации субстрата (1/[ S ]), а по оси ординат величины, обратные удельным активностям фермента (1/ V). Зависимость между 1/[ S ] и 1/ V должна быть представлена прямой линией, которая отсекает на оси абсцисс величину, равную (-1/ К_m). На оси ординат при этом она отсекает отрезок, численно равный (1/ V _max). Далее проводят расчеты для определения К_m, V _max и оптимальной концентрации субстрата.

 

Оформление результатов

Полученные данные вносят в таблицу.

 

№ про-бы	Концентрация казеина	Концентрация трипсина	Содер-жание тиро-зина, г белка	Удельная активность фермента, г белка/ ед. активности	1/Vуд
[S]	1/[S]	мкг
мг/мл	всего, мг
	75, 0	225, 0	4, 4х10-3
	50, 0	150, 0	6, 7х10-3
	25, 0	5, 0	13, 0х10-3
	12, 5	7, 5	27, 0х10-3
	6, 3	18, 9	53, 0х10-3
1/Vmax = Vmax = 1/Km = Km =
[S]opt. =

 

Контрольные вопросы и задания

1. На чем основано определение константы Михаэлиса?

2. Напишите уравнение Михаэлиса-Ментен. Раскройте физический смысл уравнения.

3. Почему используется метод Лайнуивера-Берка для определения константы Михаэлиса? Вчем суть определения.