Ферментов колориметрическим методом

Цель работы: определение протеолитической активности ферментных препаратов при различных температурах.

 

Оборудование, реактивы и материалы: аналитические и технические весы, фотоэлектроколориметр, термостат, маленькие воронки с бумажными фильтрами, пробирки, химические стаканы вместимостью 100 см³, пипетки вместимостью 1, 2 и 5 см³; раствор казеината натрия с массовой долей 2 %, универсальный буферный раствор с концентрацией 0, 1 моль/дм³ (6, 0 см³ ледяной уксусной кислоты, 6, 45 см³ ортофосфорной кислоты, 6, 18 г ортоборной кислоты, 40 г гидроксида натрия по отдельности растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 дм³; растворы уксусной, ортофосфорной и ортоборной кислот смешивают в равных объемах и добавляют раствор гидроксида натрия до получения нужного значения pH), раствор соляной кислоты с концентрацией 1 моль/дм³, раствор карбоната натрия с концентрацией 0, 5 моль/дм³, реактив Фолина (100 г фольфрамовокислого натрия и 25 г молибдата натрия вносят в круглодонную колбу вместимостью 2 дм³ с пришлифованным обратным холодильником, добавляют 700 см³ дистиллированной воды, 100 см³ концентрированной соляной кислоты и 50 см³ раствора ортофосфорной кислоты с массовой долей 85 % и относительной плотностью 1, 869. Смесь кипятят на слабом огне (можно с перерывами) на асбестовой сетке в течение 10 ч. После кипячения смесь охлаждают, переливают в колбу Эрленмейера, добавляют 150 г сульфата лития и 5 капель брома. Содержимое колбы кипятят в вытяжном шкафу на слабом огне 15-20 мин, чтобы удалить избыток брома. Готовый раствор должен иметь желтую окраску. Если раствор зеленый, обработку бромом производят вторично. После охлаждения раствор переносят в мерную колбу вместимостью 1 дм³, доливают дистиллированной водой до метки и фильтруют через стеклянный фильтр. Концентрацию кислоты проверяют титрованием разбавленного в 10 раз реактива Фолина раствором гидроксида натрия с концентрацией 0, 1 моль/дм³ по фенолфталеину. Приготовленный раствор хранят в емкости из темного стекла. При изменении цвета раствора необходимо добавить 1-2 капли брома и прокипятить. Рабочий раствор Фолина готовят разведением основного раствора дистиллированной водой в соотношении 1: 2); раствор протеолитического фермента (0, 1-1, 0 г исследуемого препарата взвешивают на аналитических весах, тщательно растирают стеклянной палочкой в стакане с небольшим количеством глицерина. Содержимое стакана количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят глицерином объем до метки. Для получения рабочего раствора 1 см³ основного раствора растворяют в 99 см³ универсального буферного раствора или воды. Рабочий раствор фермента можно хранить не более суток).

 

Теоретические сведения

 

Протеолитические ферменты (протеазы) относятся к гидролиазам, они расщепляют белки по месту пептидных связей:

 

Протеолитические ферменты находят широкое применение в различных отраслях народного хозяйства. Используются протеазы животного – пепсин, трипсин, химотрипсин, реннин (сычужный фермент) и растительного происхождения – папаин, фицин, бромелдаин. Однако наибольшее применение находят протеазы микроорганизмов, чаще всего бактерий и грибов.

В области пищевых производств наиболее перспективным является использование протеиназ для мягчения мяса, точнее, для придания ему нежных вкуса и консистенции. Способность протеолитических ферментов свертывать молоко используется в молочной промышленности при производстве сыра, сырковой массы, белковых гидролизатов молока и др. В пивоварении протеиназы применяют для стабилизации пива от помутнения.

Изменение активности растительных протеиназ зависит от периода развития растения. Повышение протеолитической активности наблюдается у незрелых и проросших семян, что отрицательно влияет на качество муки и готового хлеба, т.к. снижается эластичность клейковины муки за счет гидролиза ее белков.

Повышение протеолитической активности зерна сопровождается интенсивным накоплением аминокислот в продуктах его переработки. Аминокислоты являются источником ряда соединений (меланоидины, эфиры, сивушные масла), образующиеся при различных технологических процессах (в хлебопечении, бродильном производстве и др.), которые обусловливают вкус, цвет, аромат и качество готовых продуктов.

Большое влияние оказывают протеолитические ферменты на качество дрожжей. Увеличение протеолитической активности дрожжей приводит к повышению автолиза и резкому снижению их качества. Таким образом, протеолитическая активность растительного сырья и продуктов его переработки имеет важное значение.

Протеолитическая активность характеризует способность ферментов катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот и выражается числом единиц протеиназы в 1 г очищенного препарата или культуры гриба.

Метод определения активности основан на определении скорости ферментной реакции гидролиза белка казеината натрия под действием исследуемых протеолитических ферментов. Скорость реакции зависит от количества образовавшегося тирозина, которое устанавливают колориметрической реакцией с фенольным реактивом Фолина. В результате получается комплексное соединение, которое окрашивает раствор в голубой цвет. Интенсивность окраски определяют на фотоэлектроколориметре.

За единицу протеолитической активности принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 30 0С превращает в неосаждаемые трихлоруксусной кислотой продукты гидролиза казеината натрия в количестве, соответствующем 1 мкмоль тирозина (0, 181 мг).

Ход работы

 

Ферментативный гидролиз субстрата под действием исследуемого фермента проводят с использованием раствора с массовой долей казеината натрия 1 %. Эта концентрация образуется после смешивания растворов субстрата и фермента в соотношении 1: 1.

Два см³ субстрата (раствор казеината натрия с массовой долей 2 %) вносят в пробирку вместимостью 20 см³ и помещают в ультратермостат при температуре 30 ⁰С на 5-10 мин. Затем приливают 2 см³ рабочего ферментного раствора, смесь перемешивают и инкубируют в течение 10 мин при температуре 30 ⁰С. Сразу же по истечении времени инкубации в пробирку вносят 4 см³ раствора трихлоруксусной кислоты с концентрацией 0, 5 моль/дм³ для инактивации фермента и осаждения высокомолекулярных продуктов гидролиза белка. Смесь быстро перемешивают и выдерживают при температуре 30 ⁰С для обеспечения полноты осаждения в течение 20 мин, а затем фильтруют через бумажный складной фильтр в сухую пробирку. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен.

В сухую пробирку наливают 1 см³ фильтрата и 5 см³ раствора карбоната натрия с концентрацией 0, 5 моль/дм³, встряхивают и быстро при непрерывном перемешивании приливают 1 см³ рабочего реактива Фолина. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре (20 - 25 ⁰С) в течение 20 мин. В результате реакции образовавшихся аминокислот с реактивом Фолина раствор приобретает голубую окраску, интенсивность которой измеряют на фотоэлектроколориметре в сравнении с контрольной пробой.

Контрольную пробу готовят следующим образом. К 2 см³ ферментного раствора того же разведения, что и в опыте, приливают 4 см³ раствора трихлоруксусной кислоты с концентрацией 0, 5 моль/дм³, выдерживают в ультратермостате при 30 ⁰С в течение 10 мин, а затем к раствору добавляют 2 см³ субстрата. Содержимое пробирки перемешивают, помещают в ультратермостат на 20 мин для обеспечения полноты осаждения белка и инактивации фермента. По истечении этого времени раствор фильтруют и отбирают в сухую чистую пробирку 1 см³ фильтрата. Туда же вносят при перемешивании 5 см³ раствора карбоната натрия и 1 см³ рабочего раствора реактива Фолина. Таким образом, получают контрольный раствор, который используют в качестве раствора сравнения при колориметрировании опытного раствора. Колориметрироване производят на фотоэлектроколориметре, используя кюветы с шириной грани 10 мм и светофильтр с длиной световой волны 656-670 нм. Используя полученные значения оптических плотностей, по градуировочному графику находят количество образовавшегося тирозина, которое подставляют в расчетную формулу

 

ПА = ,

 

где ПА – протеолитическая активность, ед./г или ед./см³;

D – оптическая плотность, измеренная на фотоэлектроколо-

риметре;

4 – отношение объемов реакционной смеси и раствора фермента после добавления трихлоруксусной кислоты;

Т – тирозиновый эквивалент, Т = 1, 51;

10 – длительность гидролиза субстрата, мин;

m – количество ферментного препарата, взятого на реакцию, мг или см³;

1000 – пересчет граммов в миллиграммы.

 

Опыт повторяют при температуре 20, 30, 40, 50, 60 ^оС.

 

Оформление результатов

Полученные результаты оформляют в виде таблицы.

 

Показатели	Температура, 0С
Оптическая плотность Активность, ед/г Активность, %

 

По ним строят график зависимости А = f(t) и определяют температуру наиболее интенсивного гидролиза белка.

 

Контрольные вопросы и задания

1. Расщепление какой связи в молекуле белка катализируют протеазы? Какие продукты образуются при гидролизе?

2. Чем объяснить интенсивное накопление аминокислот в продуктах переработки зерна?

3. В чем суть метода определения протеолетической активности ферментов? С какой целью добавляется трихлоруксусная кислота?

4. За 15 мин 0, 04 мг протеазы образуют 50 мкМ тирозина при оптимальных условиях инкубации: рН 8, 0 и температура 37 °С. Рассчитайте удельную активность протеазы. Объясните, как и почему изменится активность протеазы, если:

а) рН инкубационной среды снизить до 3, 5;

б) температуру инкубационной среды повысить до 70 °С.