Влияние температуры на активность b-галактозидазы

Цель работы: определение активности b-галактозидазы при различной температуре.

Оборудование, реактивы, материалы: термостат или водяная баня, термометр, колбы Эрленмейера вместимостью 250 см³, мерная колба вместимостью 100 см³, бюретка; раствор йода с концентрацией 0, 1 моль/дм³, раствор гидроксида натрия с концентрацией 0, 1 моль/дм³, раствор соляной кислоты с концентрацией 0, 5 моль/дм³, раствор крахмала с массовой долей 10 %, раствор лактозы с массовой долей 4 %; раствор фермента с массовой долей 1 %.

Теоретические сведения

b-Галактозидаза катализирует реакцию гидролитического расщепления лактозы на галактозу и глюкозу:

 

 

 

Источниками этого фермента являются молочнокислые бактерии, кишечная палочка, молочные дрожжи и микроскопические грибы. Возросший интерес к b-галактозидазе объясняется огромными перспективами ее использования в переработке молока и молочных продуктов. Максимальная активность фермента проявляется при температуре 35-45 ^оС и рН 6, 5-8.

Об активности b-галактозидазы судят по количеству образовавшихся в результате гидролиза лактозы сахаров. Определение сахаров основано на том, что альдегидная группа взаимодействует с йодом в щелочной среде, в результате лактоза, глюкоза и галактоза окисляется до лактобионовой, глюкуроновой и галактуроновой кислот. Реакция протекает по следующему уравнению:

 

3I₂ + 6NаОН = 5NаОН + NаIO₃ + 3Н₂О,

NаIO₃ = NаI + 3О.

 

Выделившийся атомарный кислород окисляет молочный сахар в лактобионовую кислоту:

 

3C₁₂H₂₂O₁₁ + 3O = 3C₁₂H₂₂O₁₂.

лактобионовая

киcлота

 

При определении берут избыток йода, а не прореагировавший йод определяют в кислой среде титрованием гипосульфитом натрия.

 

Ход работы

 

В мерную колбу на 100 см³ пипеткой вносят 5 см³ раствора лактозы с массовой долей 4 % (или 5 см³ молока). Раствор прогревают 5-8 мин на водяной бане при заданной температуре и приливают 2 см³ водной вытяжки фермента, хорошо перемешивают, замечают время и ведут гидролиз при заданной температуре в течение 1 ч. Затем гидролиз прекращают добавлением 5 см³ раствора NаОН с концентрацией 0, 1 моль/дм³. Гидролизат доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Затем отбирают пипеткой 50 см³ гидролизата в коническую колбу на 200-250 см^З и приливают 25 см³ раствора йода и сразу же при непрерывном помешивании медленно приливают 37, 5 см³ раствора NаОН с концентрацией 0, 1 моль/дм³. Колбу закрывают пробкой и оставляют на 20 мин стоять в темноте. Затем в колбу вносят 5 см³ раствора НСl с концентрацией 0, 5 моль/дм^З и титруют выделившийся йод раствором гипосульфита натрия до получения светло-желтого раствора. Прибавляют 3-5 капель растворимого крахмала и продолжают титрование каплями до того момента, когда от одной капли раствора гипосульфита исчезнет серая окраска.

Для контроля в колбу вносят 5 см³ раствора лактозы, 25 см³ раствора йода той же концентрации, что и в опыте, 50 см³ воды и добавляют при непрерывном перемешивании 37, 5 см³ раствора NаОН. Смесь оставляют на 20 мин, дальнейшее определение ведут, как и в опытном растворе.

Активность b-галактозидазы определяют по формуле

 

АГ = ,

 

 

где АГ – активность b-галактозидазы, ед./г;

V и V ₁ – объемы гипосульфита натрия, израсходованные

на титрование контрольного и опытного растворов, см³;

0, 180 – количество лактозы, соответствующее 1 см³

раствора йода с концентрацией 0, 1 моль/дм³;

m – количество ферментного препарата, взятого на

реакцию, г.

 

Опыт повторяют при температуре 20, 30, 40, 50, 60 ^оС.

 

Оформление результатов

 

Полученные результаты оформляют в виде таблицы.

 

Показатели	Температура, оС
Объем гипосульфита натрия V1, см3 Активность, ед/г Активность, %

 

По ним строят график зависимости А = f(t) и определяют температуру наиболее интенсивного гидролиза лактозы b-галактозидазой.

 

Контрольные вопросы и задания

1. К какому классу ферментов относится b-галактозидаза?

2. Приведите структурную формулу лактозы. Какие продукты образуются при ферментативном гидролизе?

3. В чем суть метода определения активности b-галактозидазы?

Лабораторная работа № 26