Определение активности полифенолоксидазы

Цель работы: определение активности окислительно-восстановительных ферментов растительного сырья.

 

Оборудование, реактивы и материалы: аналитические и технические весы, центрифуга, бюретка, воронки, бумажные фильтры, колбы Эрленмейера вместимостью 50 см3, капельница, пипетки вместимостью 1, 2 и 5 см3, мерные колбы вместимостью 100 см3; раствор аскорбиновой кислоты с массовой долей 0, 1 %, раствор фосфорной кислоты с массовой долей 10 %, раствор крахмала с массовй долей 2 %, фосфатно-цитратный буфер с pH 7, 4 (4, 204 г лимонной кислоты растворяют в 200 см3 дистилированной воды, 35, 598 г гидроортофосфата натрия Na2HPO4·2H2O – в 1 дм3 дистиллированной воды, затем растворы смешивают из расчета 1, 83 г лимонной кислоты на 18, 17 г гидроортофосфата натрия), раствор пирокатехина с концентрацией 0, 02 моль/дм3; ферментная вытяжка полифенолоксидазы (5 г растительного сырья (муки, тонкоизмельченное зерна или солода) вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и добавляют фосфатно-цитратный буферный раствор до метки).

Теоретические сведения

 

Полифенолоксидаза, называемая также орто- дифенол-оксидазой и тирозиназой, содержится в растительных тканях и катализирует различные по механизму действия реакции: гидроксилирование монофенолов в ортофенолы и окисление молекулярным кислородом ортофенолов до ортохинонов. Последнюю реакцию можно представить такой схемой:

 

½ 2

+

Пирокатехин орто-бензохинон (орто-дифенол)

.

 

Тирозиназа играет большую роль в пищевых производствах, катализируя образование темно окрашенных продуктов, называемых меланинами. Весьма активная тирозиназа содержится в некоторых партиях пшеничной муки, в ржаной муке. Темный цвет ржаного хлеба частично объясняется окислительным действием полифенолоксидазы. Активная полифенолоксидаза обусловливает потемнение макаронных изделий, овощей, фруктов и соков.

Метод определения активности полифенолоксидазы основан на окислении пирокатехина в присутствии кислорода. Получаемый хинон постоянно подвергается восстановлению аскорбиновой кислотой в исходное вещество, аскорбиновая кислота окисляется в дегидроаскорбиновую. После окончания ферментативной реакции количество оставшейся аскорбиновой кислоты определяется взаимодействием с 2, 6-дихлорфенолиндофенолом или йодометрически.

Ход работы

В коническую колбу вместимостью 50 см³ наливают 1 см³ фильтрата, 3 см³ дистиллированной воды, 2 см³ раствора аскорбиновой кислоты с массовой долей 0, 1 % и 1 см³ раствора пирокатехина с концентрацией 0, 02 моль/дм³. Для проведения контрольного опыта берут 1 см³ предварительно прокипяченного фильтрата и все реактивы, что в рабочем опыте.

Температура всех компонентов должна быть 18-20 °С. Колбы равномерно встряхивают в течение 15 мин. Затем добавляют 1 см^З раствора фосфорной кислоты с массовой долей 10 % и титруют раствором йода с концентрацией 0, 01 моль/дм^З в присутствии крахмала.

Активность полифенолоксидазы П выражают в миллиграммах аскорбиновой кислоты

 

П = ,

 

где V и V ₁ – объем раствора йода, пошедший на титрование

контрольного и опытного растворов, см^З;

Т – масса аскорбиновой кислоты, эквивалентная 1 см^З

раствора йода, мг (Т = 0, 88);

q – масса навески муки, соответствующая 1 см^З фильтрата, г.

 

Пример расчета. Для анализа взято 5 г муки. Объем раствора йода, пошедшего на титрование контрольного и опытного растворов, составил 4, 5 и 4, 0 см^З. Данные подставляют в формулу и получают активность полифенолоксидазы

 

П = = 8, 8 мг.

 

Оформление результатов

Полученные данные вносят в таблицу.

 

Наименование продукта	Активность полифенолоксидазы
Мука
Зерно
Солод

 

 

Контрольные вопросы и задания

 

1. Назовите субстрат для полифенолоксидазы.

2. В чем суть метода определения активности полифенолоксидазы?

3. На каком принципе основан метод определения активности полифенолоксидазы?