Лабораторная работа № 36

Определение гликогена по Гуду

 

Цель работы: определение содержания гликогена в мясе.

Оборудование, реактивы и материалы: аналитические и технические весы, водяная баня, термометр, центрифуга, центрифужные пробирки, пробирки, капельницы, колбы Эрленмейера вместимостью 100 см3, цилиндры вместимостью 10 см3, пипетки вместимостью 2 и 5 см3, воронки, бюретка; раствор гидроксида калия KOH с массовой долей 60 %, раствор этанола с массовой долей 95 %, раствор соляной кислоты с концентрацией 0, 6 моль/дм3, раствор соляной кислоты с концентрацией 0, 1 моль/дм3, раствор серной кислоты с концентрацией 5 моль/дм3, раствор гипосульфита натрия 0, 005 моль/дм3, раствор растворимого крахмала с массовой долей 2 %, полный медный реактив, раствор фенолфталеина с массовой долей 1 %; мясо.

Теоретические сведения

 

Гликоген - животный крахмал, по своему строению близок к амилопектину:

СН₂ОН СН₂ОН

О

О

α -(1→ 6)- глико-зидная связь

ОН

ОН

…О _{О О}

^{ОН ОН}

СН₂ОН СН₂ОН СН₂ОН СН₂

О

О

О

О

ОН

ОН

ОН

ОН

^…

_НО О О О

^{ОН ОН ОН ОН}

	α -(1→ 4)- гликозидная связь

 

Гликоген содержится в органах животных и представляет собой резервное вещество, необходимое для энергетического обмена организма. Наиболее богаты гликогеном печень и мышцы.

 

Ход работы

 

Гликоген получают путем обработки животной ткани раствором КОН с массовой долей 60 % при 100 ⁰С с последующим осаждением этанолом. Осадок подвергают гидролизу соляной кислотой и в гидролизате определяют образующийся сахар.

Отвешивают 1 г мяса и помещают в 2 см³ раствора КОН с массовой долей 60 % в пробирке. Смесь нагревают на водяной бане при температуре кипения до полного растворения ткани (10 – 30 мин), после чего осаждают гликоген, прибавляя к еще горячей смеси 3 см³ этанола с массовой долей 95 %. Смесь подогревают до начала кипения, затем охлаждают до комнатной температуры (20±5 °С) и осадок гликогена отделяют центрифугированием. Отстой с осадка осторожно сливают, а пробирку с осадком нагревают 5 мин на водяной бане (для удаления спирта). К осадку приливают 3 см³ 0, 6 моль/дм³ НСl, осадок переносят в большую пробирку. Затем в пробирку прибавляют еще 2 см³ 0, 6 моль/дм³ HCl и нагревают раствор в водяной бане при температуре кипения. Гидролиз гликогена ведут в течение 2 ч. По окончании гидролиза гидролизат нейтрализуют 0, 1 моль/дм³ HCl в присутствии фенолфталеина (1–2 капли) до слабо-розового цвета. Объем гидролизата доводят водой до 10 см³ и содержимое пробирки перемешивают.

Вносят в колбы по 5 см³ гидролизата и приливают по 5 см³ полного медного реактива. Колбы накрывают воронками и нагревают 15 мин на водяной бане при температуре кипения, затем охлаждают до 35 ⁰С, прибавляют 1 см³ 5 моль/дм³ H₂SO₄ (при встряхивании) и спустя 2 мин титруют 0, 005 моль/дм³ раствором гипосульфита натрия. Титрование ведут в присутствии крахмала до исчезновения синего цвета. Одновременно ведут контрольное определение в смеси из 5 см³ 0, 6 моль/дм³ HCl.

Содержание глюкозы находят по израсходованному количеству гипосульфита

 

А = (V – V ₁) b·0, 45·0, 927,

 

где А – содержание гликогена в 1 г навески, мг;

V и V ₁– объем гипосульфита, пошедшего на титрование в

контрольном и опытном растворах, см³;

b – разведение анализируемой вытяжки;

0, 45 – количество глюкозы, эквивалентное 1 см³ 0, 005 моль/дм³;

раствора гипосульфита;

0, 927 – коэффициент пересчета глюкозы в гликоген.

 

Оформление результатов

Полученные данные вносят в таблицу.

 

Пробы	Объем гипосульфита, пошедший на титрование	Содержание гликогена, мг
контроль
опыт

 

 

Контрольные вопросы и задания

1. В чем сходство и различие в структуре крахмала и гликогена? Где содержится гликоген?

2. В чем суть метода определения содержания гликогена в мышцах животных?

3. Перечислите способы гидролиза гликогена. Какие ферменты участвуют в процессе гидролиза гликогена?