Методы микроскопии
Метод микроскопии позволяет изучать морфологию микроорганизмов, подвижность, отношение микробов к красителям и пр. Обычно микроскопии подвергают специально приготовленные препараты бактерий в живом или окрашенном виде (фиксированные или убитые микробы). Наибольшее распространение в микробиологии получила микроскопия окрашенных препаратов - мазков, хотя исследование микроба в живом виде имеет свои неоспоримые преимущества. Микроскопия живых неокрашенных клеток Для этого применяют два способа: висячей капли и раздавленной капли. Микроскопия живых клеток позволяет изучать бактерии в неизменном виде и обнаруживать подвижность. У крупных бактерий возможно просматривание более тонкой структуры. При микроскопии живых микроорганизмов, следует предпринимать некоторые меры предосторожности. Висячая капля. Для этого метода применяют специальные предметные стекла, которые имеют углубления в середине. Каплю исследуемого материала помещают на покровное стекло. Затем покровное стекло быстро переворачивают каплей вниз и накладывают на предметное стекло так, чтобы капля свободно свисала над углублением предметного стекла. Возможен еще один вариант: каплю наносят на покровное стекло и сверху накрывают предметным стеклом углублением над каплей. Перед этой процедурой предметное стекло недалеко от углубления смазывают вазелиновым маслом. После этого препарат совмещенных стекол быстро переворачивают, чтобы покровное стекло было наверху. Препарат микроскопируют в темном поле. Раздавленная капля. На предметное стекло наносят каплю исследуемого материала и накрывают покровным стеклом. Капля не должна выходить за края покровного стекла. Возможно окрашивание таких препаратов 0, 001 % раствором метиленовой синей или нейтрального красного. Препарат микроскопируют, затем опускают в банку с дез.раствором. Для микроскопирования применяют предметные стекла толщиной 1-1, 5 мм, а покровные толщиной - 0, 15-0, 2 мм. Приготовление мазка для окрашивания Изучение микробов в окрашенном состоянии имеет несколько положительных сторон: широкая доступность практике, простота техники обработки, безопасность микроскопии, возможность более подробного изучения их структуры и морфологии. Приготовление окрашенного препарата имеет несколько последовательных стадий: приготовление мазка, высушивание и фиксирование его, окраска мазка. Подготовка предметных стекол и мазков. Первым этапом в процессе приготовления мазка является подготовка предметных стекол. Новые стекла кипятят в 1 % растворе соды, промывают водой. Стекла бывшие в употреблении помещают на 2 ч в концентрированную серную кислоту, после чего кипятят в щелочи (сода, едкий натр), затем промывают водой. Готовые стекла хранят в склянке с притертой пробкой в 90 % спирте. Если они не хранились в спирте, их обезжиривают, например, натирая кусочком сухого мыла, а затем протирают чистой марлей. Капля воды на обезжиренном стекле растекается по поверхности. Мазок - это небольшая часть исследуемого материала, тонким слоем нанесенная на предметное стекло, с целью последующего изучения морфологии и структуры микроорганизмов. В качестве материала может быть использована кровь, колонии микробов, нативный материал от больных и пр. Если мазок готовят из бактериальной культуры, выросшей на плотной питательной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю 0, 85 % раствора хлорида натрия. Материал на бактериальной петле вносят в каплю жидкости и круговыми движениями растирают и распределяют его по предметному стеклу в виде круглого или овального мазка, диаметром 1-2 см2. Материал из гноя или мокроты забирают с помощью петли или препаровальной иглы. Выбирают гнойные кусочки и наносят в центр предметного стекла. Сверху на предметное стекло помещают второе предметное стекло, оставляя свободным левый край. Взяв за свободные концы предметных стекол, раздвигают их в стороны. В результате чего получаются два мазка на обоих стеклах. Кровь наносят на предметное стекло в виде капли недалеко от левого края. Быстро берут второе предметное стекло в правую руку и прикладывают его к нижнему стеклу под углом в 450, затем под этим же углом придвигают к капле крови, которая растекается по его нижнему краю. Плотно прижимая верхнее стекло под таким же углом к нижнему, быстро продвигают его к правому краю нижнего стекла. На нижнем стекле получается равномерный мазок крови, готовый для светового микроскопирования. Мазок-отпечаток. Это прикладывание среза органа животных или от человека, во время оперативного вмешательства, к предметному стеклу. Забор бактериальной массы для приготовления мазка. Микробы извлекают из посевов с помощью бактериальной петли. Это платиновая проволока - один конец которой загнут в виде маленького колечка, а другой вставлен в петледержатель, который и является ручкой. Петлю стерилизуют в пламени спиртовки, после чего ее следует остудить, прикоснувшись к незасеянной части питательной среды перед взятием петлей культуры. Пробирку с посевом помещают в левую руку сверху на ребро ладони между большим, указательным и средним пальцами в несколько наклонном положении. Должна быть видна вся поверхность питательной среды с культурой. Петлю берут в правую руку как писчее перо. Далее зажимают пробку пробирки правой рукой между мизинцем и поверхностью ладони, прилежащей к мизинцу, и вытаскивают ее над пламенем спиртовки. Обжигают края пробирки над пламенем и вносят стерильную петлю в пробирку, захватывают колечком петли небольшое количество культуры и не прикасаясь к стенке пробирки вынимают петлю. Края пробирки слегка обжигают и закрывают пробкой. Петлю с культурой бактерий вносят в каплю жидкости на предметном стекле и распределяют в виде равномерного мазка. Петлю прожигают и ставят на место, а затем и пробирку с культурой. Далее проводят подсушивание мазка в токе теплого воздуха горящей спиртовки или при комнатной температуре. Перегрева не допускать. Затем мазок фиксируют, трижды проводя предметное стекло с мазком над пламенем, делая круги диаметром 3 см. В результате этого микроорганизмы должны погибнуть, плотно прикрепившись к стеклу, становясь при этом восприимчивыми к окрашиванию. Возможна фиксация мазка с помощью химических растворов, потому. что не все препараты можно фиксировать над пламенем (споры, пили, жгутики и пр.). Фиксатор наливают на мазок, либо в раствор погружают предметное стекло с мазком. Наибольшее распространение получили фиксаторы - этиловый спирт (10-15 мин) и смесь Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира), фиксация 10-15 мин. Приготовленные мазки подвергают окрашиванию. Окрашивание мазка. Для окрашивания мазка применяют анилиновые красители. К настоящему времени описано достаточно много способов окраски мазков. Существуют простые и сложные методы окраски. Это деление основано на количестве используемых красителей. При применении одной из красок - метод называют простым. При последовательном применении нескольких разных красок, метод называют сложным. Простые способы можно использовать для индикации определенного штамма в смеси с другими микробами или среди структур крови, тканей и пр. Например, при поиске бруцелл мазок окрашивают карболовым фуксином. Бруцеллы окрашиваются в ярко-красный цвет, а остальные микроорганизмы в сине-голубой. Для простой окраски в основном применяют метиленовую синюю (синий цвет) и фуксин (красный цвет). Растворы красок наносят на мазок (фуксин на 1-2 мин, а метиленовую синюю на -5 мин). Затем краску сливают, мазок промывают водой, просушивают, микроскопируют. 1. Применяют фуксин водный и карболовый. а) карболовый фуксин: фуксин основной - 1 г карболовая кислота кристаллическая - 5 г спирт 96 0 - 1 мл глицерин - 4 капли вода дистиллированная - 9 мл б) водный фуксин: карболовый фуксин - 10 г дистиллированная вода - 9 мл 2. Метиленовая синяя. Готовится заранее в насыщенном растворе. а) метиленовая синяя - 10 г спирт 96о - 100 мл б) щелочная синяя: насыщенный раствор метиленовой синей - 30 г едкий натр, 1 % - 1 мл вода дистиллированная - 100 мл
Сложные методы окраски. Сложное окрашивание применяют для более детального выявления определенных структур микробов, а также для их дифференциации по способу окрашивания и пр. Наибольшее распространение и значение в микробиологии получили сложные методы окраски по Граму и Цилю-Нильсену. Особенно универсальным является метод Грама. Практически все бактерии могут при окраске по Граму проявить себя как грамположительные или грамотрицательные. Это может зависеть от многих причин: наличия клеточной стенки, присутствие в клеточной стенке пептидогликана и т.д. Метод Грама. Практически все микроорганизмы при окраске по Граму приобретают синефиолетовое окрашивание (это грамположительные) или красное (грамотрицательные). Отрицательность или положительность бактерий при окраске определяется действием на клетку спирта: при отмывании первой краски спиртом, микробы будут грамотрицательными и их необходимо докрашивать второй краской; если первая окраска не отмывается, микробы называют грамположительными и они не нуждается во втором окрашивании. Действие спирта зависит от химической структуры клеточной стенки. Методика окраски по Граму заключается в следующем: 1. На фиксированный мазок кладут небольшой кусок фильтровальной бумаги и наливают на него раствор генцианвиолета на 4-5 мин. После экспозиции бумагу снимают пинцетом, краситель сливают. 2. Наливают на мазок раствор Люголя на 1-2 мин, далее краску сливают. 3. На мазок наливают спирт 960 на 1 мин, его можно долить еще до прекращения отхождения фиолетового красителя. 4. Мазок промывают водой. 5. На мазок наносят раствор фуксина на 1-2 мин и сливают краску. 6. Мазок промывают водой, обсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют. Окраска по Граму имеет большое диагностическое значение. К грамположительным бактериям относятся: стафилококки, стрептококки, коринебактерии, микобактерии и др. К грамотрицательным бактериям относятся: менингококки, сальмонеллы, шигеллы, гонококки, протей и пр. Основная ошибка при окраске - переобесцвечивание спиртом. В настоящее время известна модификация Синева, когда на мазок кладут фильтровальную бумажку, заранее пропитанную генцианвиолетом и высушенную. На такую бумажку наносят несколько капель воды, а остальное - по прописи. Окраска по Цилю-Нильсену. Она предназначена для окраски кислотоустойчивых микроорганизмов, например, туберкулезных. Именно эту окраску применяют при выявление туберкулезных палочек в мокроте. Сущность метода заключается в одновременной окраске и разрыхлении клеточной стенки. Последующие манипуляции (обработка кислотой и второе докрашивание) дифференцируют кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии. Прокраске клеток способствует прогревание мазка. Некислотоустойчивые бактерии при обработке спиртом и кислотой обесцвечиваются и докрашиваются метиленовой синей в голубой цвет. Кислотоустойчивые микобактерии приобретают красный цвет. Окраска по Цилю-Нильсену проводится следующим образом: 1. На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумажку и наносят раствор карболового фуксина и прогревают мазок до появления паров и еще в течение 5 мин. 2. Снимают бумажку, промывают мазок водой. 3. Наносят 5 % раствор серной кислоты или 3 % раствор смеси спирта с кислотой хлороводородной, 1-2 мин для обесцвечивания. 4. Промывают мазок водой. 5. Докрашивают мазок раствором метиленовой синей, -5 мин. 6. Промывают мазок водой. Метод получил признание и имеет диагностическое значение. Окраска по Ожешко. Обычными методами споры не прокрашиваются. Сущность метода заключается в предварительном размягчении оболочки споры, а затем окрашивании. При таком способе споры хорошо прокрашиваются и не обесцвечиваются при дальнейшей обработке кислотой. В отличие от спор, вегетативные клетки обесцвечиваются и могут быть видимыми только при дополнительном прокрашивании. Окраска проводится следующим способом: 1. Просушенный, но не фиксированный мазок, обрабатывают 2 мин 0, 5 % раствором хлороводородной кислоты или соляной. 2. Прогревают препарат до появления паров, сливают кислоту. 3. Промывают водой. 4. Препарат просушивают, фиксируют над пламенем спиртовки. 5. Препарат обрабатывают карболовым фуксином Циля через фильтровальную бумажку, прогревают до появления паров и еще 4-5 мин. Фильтровальную бумажку следует снять пинцетом, а краску слить. 6. Мазок обрабатывают 5 % серной кислотой, 1-2 мин. 7. На мазок наливают метиленовую синюю, 5 мин. 8. Мазок промывают водой. Окраска по Шефер и Фултон. Сущность метода сходна с предыдущим, с некоторыми вариациями. Первично проводится не только разрыхление оболочки споры, но и ее окраска. Второй краситель докрашивает вегетативные клетки. Окраска проводится следующим способом: 1. На фиксированный мазок наносят 5 % раствор малахитового зеленого и 3-4 раза нагревают до появления паров. 2. Промывают мазок водой. 3. На мазок наносят 0, 5 % раствор сафранина на 30 сек, с целью докрашивания. 4. Мазок промывают водой. При таком способе окраски споры окрашиваются в зеленый цвет, а вегетативная клетка - в красный. Окраска по Гинсу-Бури. Этот способ основан на двух методах - Бури (окраска фона с помощью черной туши) и Гинса (прокрашивание клетки фуксином). Метод применяют при выявлении у бактерий капсулы. При этом капсула остается неокрашенной, облегая красную клетку (фуксин) или синюю (метиленовая синяя), при этом фон окрашен тушью в темный цвет. Окраска проводится следующим способом: 1. На предметное стекло наносят каплю исследуемого материала. Рядом наносят каплю туши (автоклавированной). Обе капли перемешивают и размазывают по предметному стеклу как при исследовании крови. 2. Препарат просушивают, фиксируют над пламенем спиртовки. 3. Мазок окрашивают фуксином водным или сафранином. 4. Промывают мазок водой. При этом фон темный, бактерии окрашиваются в красный цвет, их облегает кайма неокрашенной капсулы. Окраска по Нейссеру. Способ основан на избирательном отношении микробов к щелочным (волютин) и кислым (цитоплазма) красителям. Окраска проводится следующим образом: 1. На фиксированный мазок наносят ацетат синьки Нейссера, 2-3 мин. 2. Не промывая, обрабатывают мазок раствором Люголя, 10-30 сек. 3. Мазок промывают водой. 4. На мазок наносят водный раствор везувина или хрезоидина, 0, 5 - 1 мин. 5. Мазок промывают водой. При таком способе окраски зерна волютина клеток окрашиваются в темно-синий цвет, а цитоплазма докрашивается в желтый. Окраска по Романовскому-Гимзе. Сущность метода заключается в избирательном окрашивании базофильных и оксифильных элементов клеток. Окраска проводится следующим способом: 1. Мазок фиксируют химическим способом. 2. Раствор краски, приготовленный непосредственно перед употреблением, наносят на мазок, через 1 ч краску сливают. 3. Промывают мазок водой. 4. На мазок наносят 10 % раствор метиленовой синей, на 20-30 сек. 5. Препарат промывают водой. При этом способе окраски цитоплазма окрашивается в голубой цвет, ядра клеток и зернистость в красно-фиолетовый. Это основной метод изучения морфологии паразитов крови и форменных элементов крови. Окраска по Леффлеру. Этим способом окрашивают жгутики, вначале протравляя их, а затем докрашивая. Окраска проводится следующим способом: 1. Для приготовления мазка используют 10-15 суточные культуры. 2. Взвесь бактерий готовят на дистиллированной воде, для чего бактериальной петлей берут материал не прикасаясь к конденсационной воде и переносят в пробирку с 2 мл дистиллированной воды. 3. Не взбалтывая воду в пробирке, держат петлю до полного распределения культуры в воде, образующей тонкую взвесь. Пробирку ставят в термостат при 37о С на 30 мин. 4. Предметное стекло проводят над пламенем спиртовки и дают остыть. 5. Пастеровской пипеткой наносят на стекло 5 капель взвеси и подсушивают на воздухе, а затем быстро проводят над пламенем. 6. На фиксированный мазок наносят смесь для протравы, подогревая до появления паров, 1 мин. 7. Мазок промывают водой. 8. На мазок наносят фуксин Циля, слабо подогревают, 3-4 мин. 9. Мазок промывают водой. При таком способе окраски жгутики набухают, становятся видимыми и прокрашенными в красный цвет. Окраска по Здродовскому. Метод применяют для окраски риккетсий. Окраска проводится следующим способом. 1. На фиксированный в пламене мазок наносят водный раствор фуксина Циля, 5 мл. 2. Не промывая, наносят на мазок 0, 5 % раствор лимонной кислоты, 1-3 сек. 3. Промывают мазок водой. 4. На мазок наносят 10 % раствор метиленовой синей, 20-30 сек. 5. Мазок промывают водой. При таком способе риккетсии окрашиваются в розовый цвет (исключение составляют цуцугамуши, которые окрашивают по Романовскому-Гимзе). Окраска по Морозову. Способ предназначен для окрашивания вирусов, жгутиков и пр. Еще его называют серебрением. Окраску проводят следующим образом: 1. Нефиксированный мазок помещают в стакан с дистиллированной водой и фиксируют раствором № 1, одну мин. 2. Препарат вынимают из стакана, промывают водой, протравливают раствором № 2 и нагревают до появления паров, 1 мин. 3. Мазок промывают водой, после чего окрашивают раствором № 3, прогревая его до появления темно-коричневой окраски, 1-2 мин. При таком способе окрашивания вирусы или жгутики приобретают темный цвет. Окраска по Муромцеву. Это простой способ выявления телец Негри из суспензии аммониевого рога, полученной растиранием в ступе. Мазок фиксируют в смеси Никифорова. 1. Промывают мазок водой. 2. На мазок наносят синьку Мансона, 5-10 мин. 3. Промывают мазок 10 % раствором танина, 2-3 мин. 4. Наносят на мазок спирт 100о на 1, 0 мин, сливают и просушивают. При таком способе окраски тельца Негри окрашиваются бледно-фиолетовым цветом на бесцветном фоне. Прописи некоторых красителей и растворов 1. Синька Леффлера: насыщенный спиртовый раствор метиленовой синей - 30 мл КОН 10 % - 1 мл дистиллированная вода - 100 мл 2. Краситель Нейссера: 1. метиленовая синяя - 0, 1 г спирт 960 - 2 мл крепкая уксусная кислота - 5 мл дистиллированная вода - 100 мл 2. везувин - 2 г спирт 960 - 60 мл дистиллированная вода - 40 мл Смесь кипятят, по охлаждении фильтруют. 3. Краситель Морозова: Раствор № 1 (жидкость Рунге): ледяная уксусная кислота - 1 мл формалин 40 % - 2 мл дистиллированная вода - 100 мл Раствор № 2 (протрава): танин - 5 г карболовая кислота жидкая - 1 мл дистиллированная вода - 100 мл Раствор № 3 (краситель): азотнокислое серебро - 5 г дистиллированная вода - 100 мл 4. Краситель Романовского-Гимзе: Содержит смесь красителей: метиленовая синяя, эозин, азур. К 10 мл воды дистиллированной, рН 6, 8-7, 0, перед окраской добавляют 10 капель краски и тотчас наливают на мазок. 5. Краситель по Граму. 1. карболовый генцианвиолет: генцианвиолет - 1 г кислота карболовая - 2 г спирт 960 - 10 мл дистиллированная вода - 100 мл 2. раствор Люголя: калий йодистый - 2 г йод кристаллический - 1 г дистиллированная вода - 300 мл.
|
