Агарлы ортаға антибиотиктерді диффузилау әдістері

Диффузияның классикалық ә дісі. 20 минут бойы 37^оС температурада кептірілген, жаң а дайындалғ ан ортағ а жаң адан ө скен дақ ылдарды егеді. Олар ортағ а сің геннен соң ойғ ыш кө мегімен ойық шұ ң қ ыр (лунка) жасап, ішіне 0, 1 мл зерттелетін антимикробтық препарат ерітіндісін қ ұ яды. Табақ шаларды тө ң кермеген куйде мұ қ ият термостатқ а қ ояды. 18 сағ аттан кейін тест-микробтың ө су аймағ ының диаметрінің тежелуі бойынша антибиоиктердің белсенділігін анық тайды.

Дискілі-диффузиялық ә діс. Петри табақ шасындағ ы агар бетіне белгілі бір тығ ыздық тағ ы бактериалды суспензияны (ә детте McFarland бойынша лайланудың эквивалентті стандарты бойынша 0, 5) тегістеп жаяды. Дайындалғ ан суспензияның тығ ыздығ ы 1-2·10⁸ КОЕ/мл Escherichia coli концентрациясына сә йкес болуы тиіс. Бұ л концентрация МакФарленд бойынша 0, 5 оптикалық тығ ыздығ ына сә йкес келеді. Мұ ндай тығ ыздық ты Л.А. Тарасевич атындағ ы ГИСК бойынша оптикалық тығ ыздығ ы стандартты 5 бірл. болатын бактериалды суспензияны 2 есе сұ йылту арқ ылы алады. Суспензияны дайындап алғ аннан кейін 15 минут ішінде газон алу ү шін агар бетіне егеді. Осы мақ сатта ұ стағ ышта залалсыздандырылғ ан мақ та тампондарын қ олданады. Тампондарды бір рет бактериалды суспензияғ а батырып алады да, пробирка ішіндегі сұ йық тық қ а ақ ырын қ ысып тамызады. Кейін тампонды агардың бетіне штрих ә дісімен ү ш реттен жү ргізіп егіп шығ ады, ә р кез табақ шаны 60^оС бұ рып отыру қ ажет. Соң ында сол тампонмен табақ шаның қ абырғ асы бойымен жү ргізе отырып, агардың бетіне айналыдра егу жү ргізеді. Табақ шаларды бө лме температурасында15-20 минут ұ стағ аннан кейін, залалсыздандырылғ ан анатомиялық қ ысқ ышпен ортаның бетіне табақ шаның шетінен 2, 0-2, 5 см қ ашық тық та 5-6 индикатор дисктерін орналастырады. Диск пен орта арасында ауа қ алмас ү шін, орнатылғ ан диск қ ысқ ыштың басымен ақ ырын жаншылады. Табақ шаларды 30 минуттай бқ лме температурасында ұ стайды, кейін тө ң керілген кү йде 18-24 сағ атқ а термостатқ а қ ояды.

Нә тижелерді сараптау. Дақ ылдардың сезімталдығ ы залалсыздандырылғ ан аймақ тардың диаметрі мм-мен ө лшенгеннен кейін 10 кесте бойынша бағ аланады.

 

 

10 кесте.

Дискілі жә не реттік сұ йылту ә дістерімен микроорганизмдердің антибиотиктерге сезімталдығ ын анық тау нә тижелерін бағ алау

Антибиотик	Дискілер ә дісі: ө судің тежелу аймағ ының диаметрі	Сериялық сұ йылту ә дісі: минимальды ингибирлейтін концентрация мкг/мл
Тө зімділер	Умеренно устойчивые	Сезімталдар	Устойчивые	Чувстви- тельные
Бензилпенициллин	≤ 20	21-28	≥ 29	-	≤ 0.1
Ампициллин	≤ 20	21-28	≥ 29	-	≤ 0.2
Карбенициллин	≤ 14	15-18	≥ 19	≥ 32	≤ 16
Метициллин	≤ 13	14-18	≥ 19	-	≤ 3
Оксациллин	≤ 15	16-19	≥ 20	-	≤ 3
Цефалексин	-	-	-	≥ 32	≤ 10
Цефалотин	≤ 14	15-18	≥ 19	≥ 32	≤ 10
Стрептомицин	≤ 16	17-19	≥ 20	≥ 15	≤ 6
Неомицин	≤ 12	13-16	≥ 17	-	≤ 10
Канамицин	≤ 14	15-18	≥ 19	≥ 25	≤ 6
Мономицин	≤ 13	14-17	≥ 18	-	≤ 10
Гентамицин	≤ 15		≥ 16	≥ 6	≤ 4
Тетрациклин	≤ 16	17-20	≥ 22	≥ 12	≤ 2
Эритромицин	≤ 17	18-21	≥ 22	≥ 8	≤ 2
Линкомицин	≤ 19	20-23	≥ 24	≥ 8	≤ 2
Левомицетин	≤ 15	16-18	≥ 19	≥ 16	≤ 8
Рифампицин	≤ 12	13-15	≥ 16	≥ 8	≤ 2
Полимиксин	≤ 11	12-14	≥ 15	≥ 50 Ед/мл	-
Ристомицин	≤ 9	10-11	≥ 12	-	≤ 5

 

10 кестені пайдалана отырып алынғ ан нә тижелер мен мә ліметтерді бағ алап, 11 кестеге енгізу керек.

11 кесте.

Зерттелген дақ ылдардың анибиотикке сезімталдығ ын бағ алау

 

№ п/п	Антибиотик атауы	Ө судің тежелу диаметрі (мм)	Тө зімділері	Умеренно устойчивые	Сезімталдары

6 зертханалық жұ мыс. Escherichia coli мен Bacillus subtilis ө суіне пенициллин мен стрептомициннің тү рлі концентрациясының ә сері

 

Қ атты ортадағ ы титрлер ә дісі (реттік сұ йылту)

Антибиотиктердің реттік сұ йылтуларын дайындаймыз. Ол ү шін пробиркағ а 1000000 бірліктен стрептомицин мен бензилпенициллин тұ зын (сә йкесінше 1 г мен 0.5 г ұ нтақ) 10 мл суда ерітіеміз. Антибиотиктердің концентрациясы - 100000 бірл./мл. Сонан соң алдың ғ ы сұ йылтудан залалсыздандырылғ ан тамшуырмен ә рбір антибиотиктің ерітіндісінен 1 мл алып, 10 мл залалсыздандырылғ ан суы бар пробиркағ а енгіземіз. Бұ л кезде антибиотиктер концентрациясы 10000 бірл./мл болады. Ә рі қ арай келтірілген сызбанұ сқ а бойынша антибиотиктер концентрациясы - 1000 бірл./мл, 100бірл./мл жә не 10 бірл./мл болатын сұ йылтулар дайындайды..

Залалсыздандырылғ ан тамшуырмен ә рбір сұ йылтудан (10000 бірл./мл, 1000 бірл./мл, 100 бірл./мл, 10бірл./мл) 1 мл алып, ішінде ерітілген жә не суытылғ ан 4 мл агары бар пробиркағ а енгізіп, агар қ атып қ алмай тұ рып пробиркаларды қ иғ аш етіп орналастыру керек. Escherichia coli мен Bacillus subtilis дақ ылдарының ө лшемін тұ зақ пен қ атты ортаның бетіне егеді. Оларды 18-20 сағ ат ө сіреді. Антибиотиктердің тү рлі концентрациясындағ ы микрооргнаизмдердің ө су қ арқ ындылығ ын белгілеу керек. в пробирки, содержащие по 4 мл расплавленной и охлаждённой агаризованной среды, скосить пробирки до застывания агара. На поверхность плотной среды петлёй засеять взвесь культур. Посевы выращивать 18-20 часов. Отметить интенсивность роста микроорганизмов при разных концентрациях антибиотиков. Ө су қ арқ ындылығ ын клетка тығ ыздығ ы бойынша кө збен шолып бақ ылау арқ ылы анық таап, келесідей белгіленулер қ олданылады: «-» ө судің болмауы, «+» ә лсіз ө скен, «++» қ алыпты ө скен, «+++» қ арқ ынды ө скен. Тә жірибе нә тижесі кестеге енгізіледі.

 

 

12 кесте.

Микроорганизмдердің ө суіне пенициллин мен стрептомициннің тү рлі концентрациясының ә сері

антибиотик	концентрация	Escherichia coli	Bacillus subtilis
стрептомицина
бензилпенициллина
Ескерту: «-» ө судің болмауы, «+» ә лсіз ө скен, «++» қ алыпты ө скен, «+++» қ арқ ынды ө скен.

Сұ йық ортадағ ы титрлер ә дісі (реттік сұ йылту)

Бұ л ә діспен зартеліп отырғ ан бактерия дақ ылдарының (Escherichia coli мен Bacillus subtilis)ө суін ингибирлейтін антибиотиктің минимальды концентрациясын анық тайды. Алдымен қ ұ рамында арнайы ерітінді мен буфер ерітіндісіндегі антибиотиктің белгілі бір концентрациясы (мкг/мл немесе Бірл/мл) болатын негізгі ерітіндіні дайындайды. Одан сорпадағ ы барлық келесі сұ йылтуларды жасайды (кө лемі 1 мл), кейін ә рбір сұ йылтуғ а 1 мл-нің қ ұ рамында 10⁶-10⁷ бактериалды клеткалар болатын 0, 1 мл зерттелетін бактериалды суспензияны қ осады. Соң ғ ы пробиркағ а 1 мл сорпа мен 0, 1 мл бактерия суспензиясын қ ұ яды (дақ ыл бақ ылауы. Екпені келесі кү нге дейін 37^оС –та инкубациялайды да одан кейін дақ ылдың бақ ылауымен салыстыра отырып, қ оректік ортаның лайланына қ арай тә жірибе нә тижесін белгілейді. Мө лдір қ оректік ортасы бар соң ғ ы пробирка зерттеліп отырғ ан бактерия дақ ылдарының (Escherichia coli мен Bacillus subtilis) қ ұ рамындағ ы антибиотиктің минимальды ингибирлеуші концентрациясы (МИК) ә серінен ө суінің тежелуін кө рсетеді.

1 сурет. Антибиотиктің минимальды ингибирлеуші концентрациясын (МИК) анық тау.

Қ ұ рал - жабдық тар: ЕПА, Сабуро орталары бар Петри табақ шалары; ішінде ЕПС ортасы бар пробиркалар; залалсыздандырылғ ан қ ұ быр суы бар пробиркалар; бактериялар мен ашытқ ылар суспензиясы, лайлану стандарттары; антибиотиктері бар дискілер; бактериологиялық тұ зақ; 1 мл-лік тамшуырлар; Дригальский шпателі; залалсыздандырылғ ан мақ та тампондар; қ ысқ ыштар; стрептомицин мен бензилпенициллин тұ зы; спирт шамы.

 

Зертханалық жұ мыстың орындалу жоспары: