Реакция плазмокоагуляции

Принцип. Под действием фермента плазмокоагулазы активизируется естественная система свертывания крови (плазминогенротромбин).

Приготовление свежей плазмы. Стерильно взятую из сердца кровь кролика в количестве 3 мл вносят в пробирку с 2 мл стерильного 5 % раствора лимоннокислого натрия, смешивают и центрифугируют для осаждения форменных элементов крови в течение 10 минут при 1500 об/мин.

Плазму отсасывают, разводят в 5 раз стерильным физиологическим раствором и разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл.

Ход исследования. В пробирку вносят 1 петлю суточной агаровой культуры исследуемого штамма, которую суспензируют в плазме. Штатив с пробиркой помещают в термостат при 37 °С и регистрируют результаты через 1, 2, 4 и 18 часов инкубации.

Оценка результатов. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка любого размера считается положительным результатом реакции. Отсутствие свертывания плазмы в течение 18 часов расценивается как отрицательный результат. В качестве контроля рекомендуется ставить реакцию с заведомо коагулирующим и некоагулирующим штаммами, а также оставлять одну пробирку с плазмой незасеянной.

Окончательная идентификация S. aureus требует постановки еще двух тестов. На первом этапе определяют наличие у штаммов плазмокоагулазы. Если после этого штамм идентифицировать не удается, дополнительно определяют один из двух следующих признаков: наличие ДНК-азы (что предпочтительнее) или способность ферментировать маннит в анаэробных условиях.

При наличии положительного результата в реакции плазмокоагуляции и хотя бы в одном из двух предварительных тестов (пигмент лецитиназа) исследуемый штамм может быть отнесен к виду S. aureus (варианты 2-3).

Отсутствие плазмокоагулазы и хотя бы одного из двух первых признаков дает основание считать, что штамм не принадлежит к S. aureus (варианты 5-7).

Расхождения между результатами реакции плазмокоагуляции, с одной стороны, и двух предварительных тестов – с другой (варианты 4 и 8), требует постановки одного из двух дополнительных тестов (ДНК-азы или ферментации маннита в анаэробных условиях). В случае совпадения результатов дополнительного теста с результатами реакции плазмокоагуляции штамм считается либо относящимся к виду S. aureus при положительных результатах (варианты 4а и 4в), либо не относящимся к нему (при отрицательных, варианты 8б и 8г), или отрицательных (принадлежность к другим видам, варианты 4б и 4г) результатов.

Проводить идентификацию S. aureus лишь на основании результата одного теста не рекомендуется.

Определение ДНК-азы

Принцип. Под действием ДНК-азы (дезоксирибонуклеазы) добавленная в плотную среду высокополимерная ДНК распадается на низкополимерные фрагменты. При этом мутная, среда становится прозрачной.

Определение ферментации маннита в анаэробных условиях

Определение ферментации глюкозы в анаэробных условиях. Определение проводят аналогичным путем, в качестве субстрата используют 1% раствор маннита.

Идентификация S. epidermidis и S. saprophyticus

Те штаммы, которые после исследований, описанных выше, признаны не относящимися к S. aureus, подвергаются дальнейшей идентификации для установления их видовой принадлежности.

Дифференциацию S. epidermidis; и S. saprophyticus рекомендуется проводить в трех тестах:

1) определение устойчивости к новобиоцину;

2) наличие фосфатазы;

3) способность окислять маннит.

Для штаммов S. epidermidis характерны: чувствительность к новобиоцину, наличие фосфатазы, неспособность окислять маннит; для штаммов S. saprophyticus – противоположные свойства. Поскольку не все стафилококки по своим характеристикам укладываются в указанную схему, такие штаммы следует обозначать Staphylococcus Spp.

 

Вопросы для обсуждения

1. Общая характеристика патогенных кокков.

2. Морфология, тинкториальные и культуральные свойства стафилококков.

3. Токсины и ферменты "агрессии".

4. Классификация стафилококков.

5. Способы обнаружения токсинов и ферментов "агрессии".

6. Лабораторная диагностика.

7. Препараты, применяемые для специфического лечения и профилактики стафилококковых заболеваний.