Реакция плазмокоагуляцииПринцип. Под действием фермента плазмокоагулазы активизируется естественная система свертывания крови (плазминогенротромбин). Приготовление свежей плазмы. Стерильно взятую из сердца кровь кролика в количестве 3 мл вносят в пробирку с 2 мл стерильного 5 % раствора лимоннокислого натрия, смешивают и центрифугируют для осаждения форменных элементов крови в течение 10 минут при 1500 об/мин. Плазму отсасывают, разводят в 5 раз стерильным физиологическим раствором и разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл. Ход исследования. В пробирку вносят 1 петлю суточной агаровой культуры исследуемого штамма, которую суспензируют в плазме. Штатив с пробиркой помещают в термостат при 37 °С и регистрируют результаты через 1, 2, 4 и 18 часов инкубации. Оценка результатов. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка любого размера считается положительным результатом реакции. Отсутствие свертывания плазмы в течение 18 часов расценивается как отрицательный результат. В качестве контроля рекомендуется ставить реакцию с заведомо коагулирующим и некоагулирующим штаммами, а также оставлять одну пробирку с плазмой незасеянной. Окончательная идентификация S. aureus требует постановки еще двух тестов. На первом этапе определяют наличие у штаммов плазмокоагулазы. Если после этого штамм идентифицировать не удается, дополнительно определяют один из двух следующих признаков: наличие ДНК-азы (что предпочтительнее) или способность ферментировать маннит в анаэробных условиях. При наличии положительного результата в реакции плазмокоагуляции и хотя бы в одном из двух предварительных тестов (пигмент лецитиназа) исследуемый штамм может быть отнесен к виду S. aureus (варианты 2-3). Отсутствие плазмокоагулазы и хотя бы одного из двух первых признаков дает основание считать, что штамм не принадлежит к S. aureus (варианты 5-7). Расхождения между результатами реакции плазмокоагуляции, с одной стороны, и двух предварительных тестов – с другой (варианты 4 и 8), требует постановки одного из двух дополнительных тестов (ДНК-азы или ферментации маннита в анаэробных условиях). В случае совпадения результатов дополнительного теста с результатами реакции плазмокоагуляции штамм считается либо относящимся к виду S. aureus при положительных результатах (варианты 4а и 4в), либо не относящимся к нему (при отрицательных, варианты 8б и 8г), или отрицательных (принадлежность к другим видам, варианты 4б и 4г) результатов. Проводить идентификацию S. aureus лишь на основании результата одного теста не рекомендуется. Определение ДНК-азы Принцип. Под действием ДНК-азы (дезоксирибонуклеазы) добавленная в плотную среду высокополимерная ДНК распадается на низкополимерные фрагменты. При этом мутная, среда становится прозрачной. Определение ферментации маннита в анаэробных условиях Определение ферментации глюкозы в анаэробных условиях. Определение проводят аналогичным путем, в качестве субстрата используют 1% раствор маннита. Идентификация S. epidermidis и S. saprophyticus Те штаммы, которые после исследований, описанных выше, признаны не относящимися к S. aureus, подвергаются дальнейшей идентификации для установления их видовой принадлежности. Дифференциацию S. epidermidis; и S. saprophyticus рекомендуется проводить в трех тестах: 1) определение устойчивости к новобиоцину; 2) наличие фосфатазы; 3) способность окислять маннит. Для штаммов S. epidermidis характерны: чувствительность к новобиоцину, наличие фосфатазы, неспособность окислять маннит; для штаммов S. saprophyticus – противоположные свойства. Поскольку не все стафилококки по своим характеристикам укладываются в указанную схему, такие штаммы следует обозначать Staphylococcus Spp.
Вопросы для обсуждения 1. Общая характеристика патогенных кокков. 2. Морфология, тинкториальные и культуральные свойства стафилококков. 3. Токсины и ферменты "агрессии". 4. Классификация стафилококков. 5. Способы обнаружения токсинов и ферментов "агрессии". 6. Лабораторная диагностика. 7. Препараты, применяемые для специфического лечения и профилактики стафилококковых заболеваний.
|
