МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ

 

Кафедра медико-профилактических дисциплин

 

Методическое пособие для студентов

 

Микробиологическая диагностика

дифтерии и коклюша

 

г.Белгород, 2013

Род Corynebacterium прямые или слегка изогнутые палочки с неравномерно окрашивающимися участками. Иногда они содержат метахроматические гранулы, расположенные чаще всего на концах, спор не образуют, не подвижны, имеют микрокапсулу. Неподвижны, некислотоустойчивы, факультативные анаэробы. Требовательны к составу питательных сред, каталаза положительны. Некоторые виды продуцируют экзотоксины. Большинство - облигатные паразиты слизистых оболочек.

Corynebacterium diphtheriae (палочка Клебса-Леффлера) возбудитель дифтерии- острого инфекционного воспаления воздухоносных путей и кожных покровов, характеризующегося образованием фибринозных пленок и интоксикацией.

Эпидемиология. Антропонозная инфекции, источником инфекции является человек больной дифтерией и бактерионоситель токсигенного штамма коринебактерий дифтерии. Частота бактериносительства у реконвалесцента чаще 15-20 суток, но может затягиваться до 30 суток, частота носительства после болезни варьирует в пределах 1-10%.

Основной путь передачи – воздушно-капельный, также возможно заражение через предметы, используемые больным или инфицированную пищу (обычно молоко). Пик заболеваемости приходится на осенне-зимний период, в настоящее время встречается спорадическая заболеваемость среди непривытых или лиц с иммунодефицитом.

Морфология: Тонкие слегка изогнутые палочки с закругленными краями, часто утолщены на концах и напоминают булаву. Спор и капсул не образуют, на поверхности имеют фимбрии, облегчающие адгезию к эпителию слизистой оболочки.

У сorynebacterium diphtheriae выделяют три биовара – gravis, mitis intermedius. Бактерии биовара gravis короткие, неправильной формы, с небольшим количеством метахроматических гранул, биовар mitis образует длинные полиморфные палочки, содержащие большое количество волютиновых зерен (тельца Бабеша-Эрнста). Бактерии биовара intermedius более крупные с бочковидными очертаниями, характеризуются наличием поперечных перегородок. Волютиновые зерна выявляются окраской метиленовым синим или по Нейссеру. Corynebacterium diphtheriae располагаются своеобразно из-за «щелкающего»_ деления, клетки расходятся друг от друга под углом, что обусловливает характерное расположение в виде растопыренных пальцев, клинописи, латинских букв: Y,X,L.

Культуральные и биохимические свойства. Факультативные анаэробы, хорошо растут при свободном доступе кислорода, рост наблюдается в интервале 15 040 град., оптимум 36-37 град, рН 7,4-8,0. Для роста необходимы: цистин,, гистидин, фенилаланин, метионин, трептофан и другие аминокислоты, а также микроэлементы: кальций. магний, железо, марганец и медь как факторы роста. Плохо растут на простых средах, на сывороточных средах дают рост уже через 10-12 часов. Наибольшее распространение получила теллуритовая среда, основанное на резистентности бактерий к высоким концентрациям теллурита калия или натрия, ингибирующего рост контаминирующей флоры. В настоящее время используют много модификаций этой среды. Восстанавливают теллурит калия до металлического, образуют серовато-черные колонии. Типичными считают мелкие колонии, желтоватые круглые гладкие или слегка зернистые колонии. На свернувшейся сыворотке образуют крупные перламутрово-серые колонии.

Биохимическая активность сбраживают с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин и не разлагают сахарозу, лактозу маннит, а также не гидрализуют мочевину. Способность разлагать крахмал и гликоген варьирует у различных штаммов. Восстанавливает нитраты в нитриты, продуцируют каталазу, цистиназу, гиалуронидазу, нейранимидазу и ДНКазу, не образуют индол, уреазу, желатину. Обнаружение цистиназной активности в агаровом столбике с цистином используют для идентификации возбудителя (проба Пизу). Отсутствие активности в отношении сахарозы и мочевины – важный диагностический признак. Образуют бактериоцины (корицины).

Токсинообразование. Corynebacterium diphtheriae продуцируют мощный экзотоксин (впервые получили Ру и Йерсен в 1988 г). Токсин – термолабильный, высокотоксичный, иммуногенный белок, нейтрализуемый антитоксической сывороткой. Способностью к токсинообразованию обладают лишь лизогенные штаммы сorynebacterium diphtheriae, инфицированные бета-бактериофагом, несущим ген тох+, кодирующий структуру токсина.

Антигенная структура возбудителя достаточно неоднородна, Антигенный состав определяется постановкой реакции агглютинации. Различают О- К-антигены. Наиболее распространенная классификация Робинсона и Пини, выделяющая 5 сероваров, обозначаемые римскими цифрами.. В диагностике заболевания большое значение имеет РПГА, положительная у 84,5% больных. В начале заболевания РПГА отрицательная или в разведениях 1:40-1:80, а через 2 недели титры возрастают в 8-4000 раз.

Микробиологическая диагностика дифтерии.

Посев исследуемого материала на селективную дифферециально-диагностическую среду Бучина, Коринебакагар или Клауберга. При необходимости на транспортную среду. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 градусов.

Через 24 часа производят изучение выросших колоний и из части подозрительной колонии сразу ставят пробу на токсигенность и наличие фермента цистиназы. Остаток культуры с чашки засевают на скошенный сывороточный агар для получения чистой культуры.

Определение уреазной активности проводят двумя вариантами: посев в бульон с мочевиной с последующим термостатированием при температуре 37 градусов в течение 24 часов и по методу Закса: одну часть раствора А + 19 частей раствора В помещают в узкую пробирку и добавляют 1 петлю испытуемой культуры. Результат учитывается через 30 минут после термостатирования при температуре 37 градусов. Уреаза расщепляет мочевину с образованием аммиака и углекислоты. При этом изменяется цвет индикатора в среде на красный.

Учет результатов проб на токсигенность и на цистиназу на среде Пизу (состав среды: МПА+ цистин + индикатор на сероводород). В случае случаях наличия специфических линий преципитации и положительной пробе на цистиназу выдают ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии.

Посев чистой культуры используют для посева на среды Гисса с сахарами для изучения биохимических свойств (сахароза, глюкоза, крахмал и мочевина).

Повторный просмотр чашек через 48 часов проводит с помощью МБС. И производят постановку проб на токсигенность, цистиназу и отсев на скошенный сывороточный агар.

В случае использования транспортной среды продолжают ход исследования.

При отсутствии положительной находки выдают результат об отсутствии коринебактерий дифтерии

Постановка РНГА или ИФА для выявления дифтерийного токсина.

При наличии положительного результата и обнаружении фермента цистиназы и отсутствии фермента уреазы выдается предварительный ответ о выделении коринебактерии дифтерии.

Через 72 часа от начала исследования (на пятый день) производится:

Учет токсигенных свойств культур, выделенной на третий день исследования выдается ответ о выделении возбудителя дифтерии. Производится посев для определения биохимических свойств бактерий. Учет биохимических свойств культуры, выделенной во второй день исследования. Выдача результата исследования.

Через 96 часов (на 5 день) выдается окончательный ответ о выделении через 48 часов инкубации первичного посева) токсигенных или нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимических свойств.

 

Схема лабораторной диагностики дифтерии

Материал для исследования:

1. Мазок из зева и носа – при профилактическом исследовании.

2. Мазок из зева, взятый на границе здоровой и больной ткани на сухой тампон и доставка его в лабораторию не позже, чем 2 часа. Мазок из раны, слизистой половых – при атипичном поражении дифтерией.

 

1. Микроскопический метод – мазок из зева на границе здоровой и больной ткани и окраска его по Нейссеру и Граму (ориентировочный ответ при положительных находках).

 

Бактериологический метод:

1 день Посев на питательные среды Бучина, Коринебакагар, Клауберга (ЛТА+гемолизированная кровь+ FeK+ глицерин) и помещаем в термостат до следующего дня

2 день (24 часа после посева).

Просмотр посевов и выбор подозрительных на дифтерию колоний.

1. Микроскопия мазков из подозрительных колоний, окрашенных по Нейссеру и Граму.

2. Откол части подозрительной колонии на скошенный сывороточный агар для получения чистой культуры.

3. Посев на среду Пизу для определения цистиназы

4. Посев части колонии для определения токсигенности выделенной культуры.

 

3 день (48 часов после посева)

1. Учет токсигенности.

2. Определение цистиназы (состав среды МПА+цистин+индикатор на Н2S).

 

1) Цистиназополо- 2)Цистиназоотри-

жительные культуры цательные культуры

 

3. Постановка биохимических тестов

Ферментация глюкозы (+)

Ферментация сахарозы (-)

Ферментация мочевины (-) (определение фермента уреазы)

Ферментация крахмала +/-

Выдается окончательный ответ.

 

Серологический метод:

1. Для подтверждения диагноза «Дифтерия» или «Носительство + ангина».

Забор сыворотки крови производится в ранние сроки (на 1-2 день заболевания)и повторное исследование через две недели. По 4-х кратном нарастании титров антител можно предположить заболевание дифтерией.

 

 

Методы окраски:

 

По Леффлеру (метиленовым синим)

1. На фиксированный мазок наливают на 5-10 минут краску

2. Мазок промыть дистиллированной водой и высушить. Цитоплазма окрашивается в светло-сиреневый цвет, а зерна Волютина – в темно-лиловый

 

Окраска по Нейссеру

 

1.Окраска метиленовым синим: метиленовый синий - 0,1

раствор А спирт 96 град. –2 мл,

ледяная уксусная к-та -5 мл

дистил. вода до 100мл

 

3. Окраска везувином везувин - 2,0

раствор Б спирт 96 град. – 60 мл

дистил. вода - 40 мл

 

Смесь кипятят, охлаждают и фильтруют

 

1. На фиксированный мазок наливают на 1 минуту раствор А.

2. Смывают водой.

3. Наливают раствор Люголя на 20-30 секунд.

4. Не промывая наливают раствор Б на 10-15 минут.

5. Промывают, высушивают и микроскопируют, при этом цитоплазма желтая, а зерна Волютина сине-черные.

 

Посев на дифтерию

 

Зев нос

 

 

Род Bordetella – род мелких коккобацил, включает подвижные и неподвижные виды, Хемоорганотрофы, нуждаются в никотиновой кислоте, цистине и в метионине. Строгие аэробы, каталаза положительны, не образуют индола, лакмусовое молоко подщелачивают, желатин не разжижают. Углеводы обычно не ферментируют. Температурный оптимум роста 35-37 град. Неустойчивы во внешней среде. Bordetella pertussis вызывает коклюш – острое инфекционное заболевание, сопровождающееся воспалением гортани, трахеи и бронхов. Впервые был выделен Борде и Жангу (1906), также предложили культуральную среду, bordetella parapertussis – возбудитель паракоклюша, отличающегося серологически в реакции агглютинации с антисыворотками, подвижности и способности утилизировать цитрат.

Bordetella bronchiseptica вызывает респираторное заболевание, напоминающее коклюш у щенков и у кроликов. Редко вызывает ОРВИ у человека, обычно у работников соответствующих хозяйств (собачьих питомников и кроличьих ферм).

Морфология. Клетки плохо окрашиваются по Граму, предпочтительней использовать толуидиновый синий, выявляющий биполярные метахроматические гранулы. Образуют микрокапсулу, хорошо выявляемую при культивировании микробов в присутствии иммунной сыворотки. На твердых средах (агар Борде-Жангу, казеиново-угольная среда (КУА) или молочно-кровяной агар) на 2-6 сутки формируют небольшие сероватые колонии (иногда желтоватые), напоминающие капельки ртути или жемчужины. Колонии имеют маслянистую консистенцию и хорошо снимаются с поверхности среды, можно наблюдать луч света (хвостик), отходящий от центра колонии. На средах содержащих кровь образуют зоны слабого гемолиза.

Культуральные свойства. Бордетеллы требовательны к условиям культивирования. Классической средой для первичного выделения являются среды Борде-Жангу и КУА

Антигенное строение. У бордетелл выделяют общие (родовые) и специфические (видовые) антигены. Видовые антигены обозначают как факторы: для бордетелл коклюша фактор –1, для паракоколюша – 12, для бронхисептика –14. Фактором вирулентности является эндотоксин, подобный по механизму действия токсину холерному, дифтерийному и синегнойной палочки.

 

Микробиологическая диагностика коклюша и паракоклюша.

 

1.Бактериологический метод.

Исследуемый материал – мазок с задней стенки глотки или методом кашлевых пластин засевается на две чашки.

 

1 этап: Посев на чашку со средой Борде-Жангу (крахмал, глицерин, кровь и агар-агар) или КУА (гидролизат казеина, активированный уголь, агар-агар с пенициллином).

 

2 этап: Инкубация посевов при 35-37 градусах 3-5 дней с просмотром в стереоскопическом микроскопе или с помощью лупы. Обнаружение характерных колоний «капли рассыпанной ртути с лучами летящего метеорита».

 

3 этап: Ориентировочная идентификация с помощью реакции агглютинации и микроскопии мазка, окрашенного по Граму. От кол подозрительных колоний на чашку или скошенную среду Борде-Жангу или КУА.

 

4 этап: Окончательная идентификация путем серологического типирования и по ферментативным (биохимическим) свойствам.

 

Серологический метод: РА, РНГА, ИФА. Используется сыворотка крови больного в динамике с интервалом в 2 недели.

 

Посев на коклюш

 

Для получения изолированных

колоний посев проводят путем

втирания тампона по периферии

чашки (в виде 4-5 площадок, а

затем Z- образным штрихом в цен-

тре. Среди выросших колоний отби-

рают подозрительные и отсевают на

отдельные чашки.

 

Тесты для контроля уровня знаний.

 

Укажите латинское название:

1. Возбудителя дифтерии

2. Возбудителя коклюша

 

Дополните:

3. Для выявления возбудителя дифтерии в мазке можно использовать окраску_____________

4. Для посева материала на дифтерию используют среду______________

5. Для культивирования бордетелл используют среды_____________

6. Патогенез заболевания дифтерией определяет_______________

Выберите правильный ответ

7. Токсигенность коринебактерии дифтерии обусловлена фаговой конверсией.

8. Все штаммы коринебактерии дифтерии продуцируют экзотоксин.

9. Заболевание дифтерией вызывают все коринебактерии дифтерии.

10. Коринебактерии дифтерии представляют собой:

1. грамотрицательные кокки;

2. грамотрицательные палочки;

3. грамположительные палочки;

4. грамположительные коккобактерии.

11.Зерна Волютина у коринебактерий выявляются с помощью окраски по:

1. Граму;

2. Цилю-Нильсену;

3. Бурри-Генса;

4. Леффлера;

5. Ожешко.

11. На поверхности питательных сред с теллуритом калия образуются колонии коринебактерий дифтерии:

1. Гладкие, прозрачные;

2. шероховатые мутные;

3. мелкие синие;

4. мелкие серовато-черные;

5. Все перечисленное.

13.Ферментативные свойства возбудителей дифтерии:

1. уреаза(-), цистиназа (+);

2. уреаза(+), цистиназа (-);

3. уреаза(-), цистиназа (-);

4. Глюкоза (-);

5. сахароза (+).

14. Патогенность дифтерийных палочек связана с наличием у них:

1. фимбрий;

2. экзотоксина;

3. ферментов гиалуронидазы, нейраминидазы, фибринолизина;

4. корд-фактора;

5. всех перечисленных.

15. Токсинообразование коринебактерий связано с:

1. корд-фактором;

2. Лизогенизацией;

3. зернами Волютина;

4. Ферментацией глюкозы;

5. микрокапсулой.

16. Токсигенность коринебактерий определяется в реакциях:

1. Шика;

2. агглютинации:

3. Кольцепреципитации;

4. преципитации в геле по Оухтерлони;

5. РПГА.

17. Введение дифтерийного анатоксина в организме человека обеспечивает иммунитет:

1. Антитоксический;

2. Антимикробный;

3. Противоопухолевой

4. Антивирусный

5. Антигрибковый

18 культивирование бордетелл коклюша производят на:

1. МПА;

2. МПБ;

3. Левенштенна-Йенсера

4. Борже-Жпнгу,КУА;

6. На всех перечисленных.

19. Рост колоний бордетелл коклюша появляется через:

1. 24 часа;

2. 48-72 часа;

3. 12-24 суток;

4. 12 часов;

5. 60-90 дней.

20. Патогенность бордетелл связана с наличием:

1. фимбрий;

2. экзотоксина;

3. эндотоксина;

4. гиалуронидазы;

5. всех перечисленных признаков.

\

 

 

Литература:

1.Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология: М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2001.-926С.

2.Воробьев А.В., Быков А.С.,,Пашков Е.П.,Рыбакова А.М. Микробиология: Учебник.- 2-е изд. перераб. и доп.- М.: Медицина, 1998.- 336 С.

3. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Учебник.- СПб: «Специальная литература» 1998.- С. 502.

4.Медицинская микробиология Учебник под ред. В.И. Покровского. Москва ГЭОТАР Медицина,2001.-1200 С.

5.Маянский А.Н. Микробиология для врачей (очерки патогенетической микробиологии). Нижний Новгород. Из-во Нижегородской медицинской академии, 1999.- 400С.

 

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ