РАЗДЕЛ 5. ХИМИЯ И ОБМЕН ЛИПИДОВ

 

РАБОТА 11. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ОБЩЕГО ХОЛЕСТЕРОЛА В СЫВОРОТКЕ И ПЛАЗМЕ КРОВИ ЭНЗИМАТИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Цель работы: ознакомиться с одним из самых распространенных в клинической биохимии методов определения холестерола.

Задачи:

· определить содержание общего (свободного и этерифи-цированного) холестерола в предложенной сыворотке крови;

· проанализировать полученные результаты и сделать вывод.

Принцип метода. При гидролизе эфиров холестеридов холестеролэстеразой образуется холестерол. Общий холестерол (свободный и этерифицированный) окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества пероксида водорода:

В присутствии пероксидазы перекись водорода окисляет фенол, который превращается в бензохинон, имеющий розовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерола.

Ход работы. В две обычные химические пробирки наливают:

1) в опытную – 0,02 мл сыворотки (или плазмы) крови,

2) в стандартную – 0,02 мл стандартного раствора холестерола.

Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента, реакционную смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 5 минут при 37°С. Затем измеряют оптическую плотность опытной и стандартной проб против контроля (кювета с рабочим реагентом) в кюветах с рабочей длиной 5 мм (или 3 мм) при длине волны 490-500 нм.

Окраска проб стабильна в течение 2 часов при условии отсутствия воздействия прямых солнечных лучей.

Результаты: расчёт количества общего холестерола проводят по формуле:

С = Е_о/Е_ст × 5,17 (ммоль/л) или С = Е_о/Е_ст × 200 (мг/100мл),

где Е_о – экстинкция опытной пробы,

Е_ст – экстинкция стандарта.

Содержание холестерола в сыворотке крови здоровых людей разного возраста колеблется в пределах:

20-29 лет – 3,72-7,11 ммоль/л (144-175 мг/дл),

30-39 лет – 4,27-7,63 ммоль/л (165-295 мг/дл),

40-49 лет – 4,40-8,15 ммоль/л (170-315 мг/дл),

старше 50 лет – 4,58-8,79 ммоль/л (177-340 мг/дл).

Выводы:

 

 

РАБОТА 12. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРОЛА ЛИПОПРОТЕИНОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Цель работы: ознакомиться с современным и самым распростра-нённым в клинической биохимии методом определе-ния α-холестерола в сыворотке крови.

Задачи:

· определить содержание холестерола липопротеинов высокой плотности (α-холестерола) в сыворотке крови;

· рассчитать холестериновый индекс атерогенности (ХИА);

· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.

Принцип метода. Хиломикроны (ХМ), липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеины низкой плотности (ЛПНП) осаждаются фосфорновольфрамовой кислотой и Mg²⁺ и отделяются центрифугированием. Липопротеины высокой плотности (ЛПВП) остаются в надосадочной жидкости (супернатанте) и количество холестерола в них определяется так же, как концентрация общего холестерола, энзиматическим методом.

Ход работы

а) Осаждение ЛПОНП и ЛПНП

В три центрифужные пробирки наливают:

1) в опытную – 0,15 мл исследуемой сыворотки крови,

2) в стандартную – 0,15 мл стандартного раствора холестерола,

3) в контрольную – 0,15 мл дистиллированной воды.

Во все пробирки добавляют по 0,3 мл осаждающего реагента. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и оставляют на 10 минут при комнатной температуре. Затем опытную пробу центрифугируют в течение 15 минут при 3000 оборотах в минуту и прозрачный центрифугат используют для определения холестерола ЛПВП (α-холестерола). Стандартную и контрольную пробы можно не центрифугировать.

б) Определение концентрации α-холестерола

В три обычные химические пробирки (опытную, стандартную и контрольную) аккуратно автоматической пипеткой переносят по 0,2 мл жидкости из соответствующих центрифужных пробирок и добавляют по 2,0 мл рабочего реагента. Реакционную смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 5 минут при 37°С. Затем измеряют оптическую плотность опытной и стандартной пробы против контроля в кюветах на 5 мм при длине волны 490-500 нм.

Результаты:

1. Концентрацию холестерола ЛПВП (α-холестерола) рассчитывают по формуле:

С = Е_о/Е_ст × 1,29 (ммоль/л) или С = Е_о/Е_ст × 50 (мг/дл),

где Е_о и Е_ст – экстинкции опытной и стандартной проб.

2. Холестериновый индекс атерогенности (ХИА) расчитывают по формуле:

ХИА = (общий холестерол – α-холестерол) / α-холестерол

В норме величина холестеринового индекса атерогенности ≤3,0.

Выводы: